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生命科学
酶联免疫吸附测定
流式细胞术
细胞分选
细胞培养
酶联免疫吸附测定

酶联免疫吸附测定 (ELISA) 是一种广泛应用于生物学和医学科学的免疫酶技术,用于定量测定各种生物基质样品中的抗体、抗原、糖蛋白、糖脂等分子。ELISA检测法依赖于抗原-抗体相互作用,结合酶/底物的催化作用,可以特异性识别复杂生物基质中目标分子。目前主要有4种形式的 ELISA 方法,包括直接 ELISA检测法、间接 ELSIA检测法、夹心 ELISA检测法和竞争性 ELSIA检测法。无论采用哪种形式,重要的是选择合适的固定抗原或捕获检测抗体对,以确保方法的特异性和灵敏度。

流式细胞术

流式细胞技术 (FCM) 是利用流式细胞仪将单个细胞传送通过光测量点,经不同波长的散射光,检测到具有荧光标记抗体(和细胞表面抗原组合)的细胞,并在细胞图上记录出来。 FCM 的优势是在于可以在短时间内(几十秒到几分钟)测量大量单个细胞,从而可以揭示细胞群的异质性,并且可以识别、量化和分类不同的细胞亚群以供进一步研究。 FCM越来越多地应用于细胞周期、细胞生理学、免疫表型等研究领域。

细胞分选

磁性细胞分选技术是利用磁性粒子偶联识别细胞表面抗原的高特异性抗体分离特定亚群的活细胞。基于磁场的磁性选择和抗体-抗原的相互作用,将目标细胞从血液或组织中分离出来。该技术被广泛用于从人和动物组织或血液样本中分离全T细胞、CD4+T细胞、单核细胞、B细胞、干细胞、NK细胞、树突细胞、内皮细胞、肿瘤细胞、白细胞、粒细胞等。特定的细胞亚群从磁珠中释放出来,几乎不受任何损伤,可直接用于细胞培养、流式细胞术和基于细胞的检测等下游应用。

细胞培养

细胞培养技术使得在实验室内体外模拟细胞分化和代谢功能成为可能。

原代细胞是从人类或动物供体组织中直接分离出来的细胞,已高度分化且接近起源组织,但通常不具有增殖性。而永生化的细胞系是从肿瘤或组织中分离出来的、可在体外培养并稳定增殖的细胞,但通常在遗传学和表型上与其起源细胞存在较大的差异。

就培养方法而言,多数源自组织的细胞,比如胚胎 (hESCs) 和间充质干细胞、纤维细胞或肝细胞,需要在细胞培养瓶或多孔板或滚瓶的表面贴壁生长。贴壁培养的细胞增殖受到培养容器的可用表面积的限制。血液细胞系或经驯化后的一些组织细胞也可在摇瓶中悬浮生长。经改造的工程细胞系可悬浮培养于生物反应器中,用于大规模生产生物类药品。

应用科学
药物筛选
遗传毒性研究
生物分析
室间质评与能力验证
药物筛选

新药开发过程通常包括临床前研究、临床试验、报批和生产上市4个阶段。药物代谢研究在新药开发的前两个阶段具有重要的指导意义,尤其是在代谢信息不明确的开发早期。

通过利用各种体外代谢模型对候选化合物的代谢特性(如代谢稳定性、代谢产物生成、代谢表型、酶抑制IC50等)进行高通量筛选,可以对代谢过快或生成毒性代谢物的候选化合物进行结构改良,或通过合成活性代谢物或模拟活性代谢物的结构得到新的候选化合物。

与体内代谢研究相比,体外代谢研究可在新药研发早期利用候选化合物的体外代谢参数合理预测候选化合物的体内药动学行为,指导后期药效、药动以及安全性评价的模型选择,缩小体内研究的筛选范围。

遗传毒性研究

遗传毒性研究(Genotoxicity Study)是药物非临床安全性评价的重要内容,与其他研究尤其是致癌性、生殖毒性等研究有着密切的联系,是药物进入临床试验及上市的重要环节。拟用于人体的药物,应根据受试物拟用适应症和作用特点等因素考虑进行遗传毒性试验。遗传毒性试验是指用于检测通过不同机制直接或间接诱导遗传学损伤的受试物的体外和体内试验,这些试验能检测出DNA损伤及其损伤的固定。

遗传毒性试验方法有多种,根据试验检测的遗传终点,可将检测方法分为三大类,即基因突变、染色体畸变、DNA损伤;具体的试验内容包括细菌回复突变试验(Ames试验),体外染色体畸变试验,体外微核试验,体外小鼠淋巴瘤L5178Y细胞TK基因突变试验,HGPRT基因突变试验,彗星试验等。

IPHASE品牌针对遗传毒性各项试验,分别开发出遗传毒性Ames试剂盒,体外染色体畸变试剂盒,体外微核试验试剂盒,TK染色体畸变试剂盒,HGPRT基因突变试剂盒,彗星试验试剂盒等,大大提高各个遗传毒性试验的完成效率,省去试验试剂配制准备验证等各个环节,大大缩短实验人员实验时间。

生物分析

质谱检测中,不可避免的会遇到基质效应,为了验证基质带来的影响,需要使用空白基质,若分析物为外源性物质(大多数药物,环污染物等)都可以使用正常人或动物的生物样品(血浆,血浆,尿液,胆汁等)作为正常的BLANK,单如果分析物为内源性物质(正常人或动物体内本身含有的皮质醇,胆红素,维生素等),就很难获得空白基质,这种情况下,想要去除生物样本中的内源性物质很难完成,可以使用人工基质,模拟人体或动物体内环境配置而成,成分明确,有效解决内源性物质干扰问题。

IPHASE品牌空白生物基质产品,包括不同种属动物空白血清,血浆,尿液,胆汁,粪便,组织等空白基质,人工血浆,人工尿液,人工胃液,人工小肠液等人工基质,为创新药物研发机构生物分析研究,大分子药物生物分析,小分子药物生物分析,如方法学开发,方法学确证,药代动力学分析,毒代动力学分析等提供专业产品与专业服务。

室间质评与能力验证

室间质量评价也被称作能力验证,是国际公认的临床实验室全面质量管理的重要组成部分,也是医疗机构质量管理的重要内容。室间质量评价是为确定某个实验室进行某项特定校准或检测能力以及监控其持续能力而进行的一种实验室间的比对。

IPHASE拥有专业的综合分子检测平台,十余年分析检测经验,长期为中国疾病预防控制中心,国家食品安全风险评估中心,卫健委临床检验中心,北京市临床检验中心提供能力验证相关标准物质与质控品。

技术应用:
小鼠外周血单个核细胞的应用 2022-05-20
小鼠外周血单个核细胞采用密度梯度离心法结合差速贴壁法分离自外周血;外周血是除骨髓之外的血液,临床上常用一些方法把骨髓中的造血干细胞释放到血液中,再在从血液中提取分离得到造血干细胞,把这样得到的干细胞称为外周血干细胞,在二十一世纪初人类开始的生命方舟计划中首次提出外周血这一新概念。 单核细胞起源于骨髓中的造血干细胞,并在骨髓中发育。当它们从骨髓进入血液时仍然是尚未成熟的细胞。与其他血细胞比较,单核细胞内含有更多的非特异性脂酶,并且具有更强的吞噬作用。单核细胞在血液中停留2-3天后迁移到周围组织中,细胞体积继续增大,直径可达50-80μm,细胞内所含的溶酶体颗粒和线粒体的数目也增多,成为成熟的细胞。 小鼠外周血单个核细胞 固定在组织中的单核细胞称为组织巨噬细胞,它们经常大量存在于淋巴结、肺泡壁、骨髓、肝和脾等器官。激活了的单核细胞和组织巨噬细胞能生成并释放多种细胞毒、干扰素和白细胞介素,参与机体防卫机制,还产生一些能促进内皮细胞和平滑肌细胞生长的因子。在炎症周围单核细胞能进行细胞分裂,并包围异物。 应用[4][5] 用于苯短期重复染毒对小鼠外周血单个核细胞及脾脏免疫功能的影响研究 通过构建苯染毒小鼠模型,从免疫器官、免疫细胞和免疫分子等多个水平研究苯染毒对小鼠外周血单个核细胞及脾脏的免疫毒性,为进一步探究苯的免疫毒性效应及其作用机制提供实验研究依据。 方法:1.将40只6-8周龄的雄性无特定病原体级BALB/c小鼠随机分为4组:对照组(玉米油)、低剂量组(50mg/kg)、中剂量组(150mg/kg)和高剂量组(500mg/kg),每组10只。每天经口灌胃1次,每周5天,连续4周。染毒期间每周观察记录小鼠体重变化,末次染毒24小时后进行各项指标的检测。 2. 采取小鼠的外周血进行血常规分析;使用酶联免疫吸附试验测定血浆中免疫球蛋白G、白介素-2和白介素-6的含量;使用Mito SOX荧光染料结合流式细胞术测定小鼠外周血单个核细胞线粒体ROS含量,使用ATP测定试剂盒和BCA蛋白测定试剂盒测定小鼠外周血单个核细胞ATP的含量;使用硫代巴比妥酸法测定丙二醛的含量、二硫代二硝基苯甲酸法测定谷胱甘肽过氧化物酶的活力、羟胺法测定总超氧化物歧化酶的活力。 3. 无菌解剖小鼠,摘取脾脏并计算脾脏系数,并对小鼠脾脏进行病理学检查;使用TUNEL检测试剂盒检测脾脏细胞的凋亡情况;使用Cell Counting Kit-8试剂盒测定小鼠脾脏中T、B淋巴细胞增殖能力。 4.应用同位素标记相对和绝对定量技术分析比较高剂量组和对照组中小鼠的脾脏蛋白质表达差异,利用Gene Ontology和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes数据库对差异蛋白进行生物信息学分析,找出关键差异表达蛋白并应用Wes全自动蛋白定量分析系统和实时荧光定量PCR技术验证差异蛋白及其相应的mRNA表达水平。#细胞# 参考文献 [1]Carcinogenicity of benzene[J].Dana Loomis,Kathryn Z Guyton,Yann Grosse,Fatiha El Ghissassi,Véronique Bouvard,Lamia Benbrahim-Tallaa,Neela Guha,Nadia Vilahur,Heidi Mattock,Kurt Straif.The Lancet Oncology.2017(12) [2]Regulation of Signal Transduction by Reactive Oxygen Species in the Cardiovascular System[J].David I.Brown,Kathy K.Griendling.Circulation Research.2015(3) [3]Benzanthrone induced immunotoxicity via oxidative stress and inflammatory mediators in Balb/c mice[J].Prachi Tewari,Ruchi Roy,Sakshi Mishra,Payal Mandal,Ashish Yadav,Bhushan P.Chaudhari,Rajnish K.Chaturvedi,Premendra D.Dwivedi,Anurag Tripathi,Mukul Das.Immunobiology.2014 [4]Diamond–Blackfan anemia with mandibulofacial dystostosis is heterogeneous,including the novel DBA genes TSR2 and RPS28[J].Karen W.Gripp,Cynthia Curry,Ann Haskins Olney,Claudio Sandoval,Jamie Fisher,Jessica XiaoLing Chong,Lisa Pilchman,Rebecca Sahraoui,Deborah L.Stabley,Katia SolChurch.Am.J.Med.Genet..2014(9) [5]胡辉.苯短期重复染毒对小鼠外周血单个核细胞及脾脏免疫功能的影响[D].军事科学院,2019.
外周血单个核细胞(PBMC) 2022-05-19
1    PBMC简介 外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)是外周血中具有单个核的细胞,是白细胞(WBC)的一个子集,白细胞是机体免疫系统对抗疾病的组成部分。PBMC主要由淋巴细胞(T细胞、B细胞和NK细胞)和单核细胞组成,通过密度梯度离心从外周全血中分离。PBMC被广泛应用于药物发现/开发、分析验证/开发和其他免疫学相关研究中。 2    IPHASE产品 IPHASE/汇智和源顺应药物开发和免疫学研究等的需求,不断优化PBMC的提取工艺,形成了各种属高质量的PBMC产品,如人PBMC、猴PBMC、犬PBMC、大鼠PBMC、小鼠PBMC、猫PBMC、小型猪PBMC、兔PBMC等。根据客户的使用要求和习惯,我们可提供新鲜分离和液氮冻存两种形式的PBMC产品,客户可根据实际需求和产品自身特性选择并订购满足要求的产品。新鲜分离的PBMC可很大程度的保留PBMC中稀有细胞的占比,但货期相对较长,试验时间需根据提取时间调整;液氮冻存的PBMC复苏存活率可达90%以上,基本可满足大部分客户的需求,随用随取,可任意安排试验时间,但冻存难免会对细胞造成一定的损伤,如需研究稀有细胞难免会对试验结果造成一定干扰。 3    IPHASE产品特点 l  来源清晰 IPHASE/汇智和源生产PBMC所用血液均由正规生产商采集,进口的人PBMC产品均有伦理和知情,免除了后顾之忧。 l  产品安全   IPHASE/汇智和源PBMC生产所用动物均经过传染源检测,使用更安全、更放心。 l  纯度高 IPHASE/汇智和源的PBMC产品均根据种属特异性使用专用分离液进行提取,产品纯度高。 l  活性好 IPHASE/汇智和源的PBMC产品复苏活性较好,可达90%以上。 除此之外,IPHASE/汇智和源可根据客户特殊需求,提供不同种属和特殊种属动物PBMC产品的定制服务和人PBMC产品的进口服务,望广大科研工作者来电咨询,咨询热线400-127-6686。 4    相关产品 购买方式: 电话:网页右侧或左下角电话联系 微信:直接扫描右侧微信二维码添加购买
动员外周血单个核细胞 2022-05-16
1    动员外周血单个核细胞简介 正常人外周血中的干/祖细胞的含量占有核细胞数的1%左右,经有效动员后,骨髓中的造血干细胞会释放到外周血中,使外周血中的干/祖细胞比例明显增高。动员外周血是指用有效的动员剂对供者进行动员后采集的外周血,其各亚型细胞的数量、细胞免疫表型、分泌细胞因子能力和增殖能力等可能会与未动员外周血有一定差异。 2    IPHASE动员外周血单个核细胞 IPHASE/汇智和源动员外周血单个核细胞是采集经重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)动员后的健康供者的外周血,采用密度梯度离心的方法提取其单个核细胞。本产品以液氮冻存形式提供,复苏存活率可达90%以上,随取随用,真正满足了客户任意安排试验的需求。 3    IPHASE产品特点 l  来源清晰 IPHASE/汇智和源动员外周血相关产品均从国外进口而来,有伦理和知情,免除了后顾之忧。 l  产品安全   IPHASE/汇智和源产品的血液供者均经过传染源检测,使用更安全、更放心。 l  纯度高 IPHASE/汇智和源的动员外周血相关产品均使用专用试剂或试剂盒进行提取,产品纯度高。 l  活性好 IPHASE/汇智和源的动员外周血相关产品复苏活性较好,可达90%以上。 除此之外,IPHASE/汇智和源可根据客户特殊需求,提供不同种属和特殊种属动物PBMC产品的定制服务和人PBMC产品的进口服务,望广大科研工作者来电咨询,咨询热线400-127-6686。 4    相关产品 关    于    我    们 汇智和源,致力于为创新药研发企业及生命科学研究机构提供高品质的生物试剂,IPHASE为公司核心品牌,品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。
动员外周血单个核细胞分离方法和注意事项 2022-04-12
1 原理 2 方法 图1 稀释动员外周血离心前后的分层状态图 3 注意事项 4 动员外周血单个核细胞分离试剂盒 5 相关产品 关    于    我    们 汇智和源,致力于为创新药研发企业及生命科学研究机构提供高品质的生物试剂,IPHASE为公司核心品牌,品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。 购买方式: 电话:网页右侧或左下角电话联系 微信:直接扫描右侧微信二维码添加购买
骨髓单个核细胞分离方法及注意事项 2022-04-06
1 原理 2 方法 图1 稀释骨髓液离心前后的分层状态图 3 注意事项 4 脐带血单个核细胞分离试剂盒 5 相关产品 关    于    我    们 汇智和源,致力于为创新药研发企业及生命科学研究机构提供高品质的生物试剂,IPHASE为公司核心品牌,品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。 购买方式: 电话:网页右侧或左下角电话联系 微信:直接扫描右侧微信二维码添加购买
脐带血单个核细胞分离方法和注意事项 2022-03-31
01 原理 2 方法 图1 稀释脐带血离心前后的分层状态图 3 注意事项 4 脐带血单个核细胞分离试剂盒 5 相关产品 关    于    我    们 汇智和源,致力于为创新药研发企业及生命科学研究机构提供高品质的生物试剂,IPHASE为公司核心品牌,品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。 购买方式: 电话:网页右侧或左下角电话联系 微信:直接扫描右侧微信二维码添加购买
脾脏单个核细胞分离方法及注意事项 2022-03-08
1 原理 2 方法 图1 脾脏研磨方法示意图 图2 细胞悬液离心前后的分层状态图 3 注意事项 4 脾脏单个核细胞分离试剂盒 5 相关产品 关    于    我    们 汇智和源,致力于为创新药研发企业及生命科学研究机构提供高品质的生物试剂,IPHASE为公司核心品牌,品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。 购买方式: 电话:网页右侧或左下角电话联系 微信:直接扫描右侧微信二维码添加购买
动员外周血单个核细胞分离方法和注意事项 2022-02-19
1 原理 2 方法 图1 稀释动员外周血离心前后的分层状态图 3 注意事项 4 动员外周血单个核细胞分离试剂盒 5 相关产品 关    于    我    们 汇智和源,致力于为创新药研发企业及生命科学研究机构提供高品质的生物试剂,IPHASE为公司核心品牌,品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。 购买方式: 电话:网页右侧或左下角电话联系 微信:直接扫描右侧微信二维码添加购买
药物转运体的研究方法 2022-02-10
药物转运体的研究方法 Methods for the study of drug transporters 作者单位 李 聃, 盛 莉 , 李 燕 中国医学科学院 北京协和医学院药物研究所药物代谢室 天然药物活性物质与功能国家重点实验室 活性物质发现与适药化研究北京市重点实验室 摘 要 位于细胞膜上的转运体是体内重要的功能性膜蛋白 , 在药物吸收、分布、代谢及排泄的动力学过程中发挥重要作用。 转运体的功能缺失或抑制是引起药物相互作用及某些疾病的重要原因。 了解转运体的功能对阐明药物的体内药代动力学特征、药效及毒性具有重要意义。 本文对目前常用的主要药物转运体的研究方法进行综述。 正文 药物转运体是位于细胞膜上的功能性膜蛋白。 人体内参与药物跨膜的转运体种类众多 , 按底物跨膜转运方向可分为参与药物吸收和外排的两大类转运体。 吸收转运体: 介导药物进入细胞的转运体可将底物摄取至靶位以发挥药效, 属于可溶性载体 (solutecarrier, SLC), 主要包括氨基酸转运体 (L-type amino transporter, LAT)、 寡肽转运体 (peptide transporters, PEPTs)、 钠依赖性续发性主动转运体 (sodium dependent secondary active transporters, SGLTs) 、 钠非依赖性易化扩散转运体(sodium-independent facilitated diffusion transporters,GLUTs)、 一元羧酸转运体 (monocar-boxylate transporter,MCT)、 有机阴离子 (organic anion transporters, OATs) 及阳离子转运体 (organic cation transporters, OCTs)等 。 外排转运体: 介导药物外排的转运体主要包括 P糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)、 多药耐药相关蛋白 (multidrug resistance associated proteins, MRPs)、 乳腺癌耐药蛋白 (breast cancer resistance protein, BCRP) 及胆酸盐外排泵 (bile salt export pump, BSEP), 属于ATP结合盒转运体 (ATP binding cassette, ABC) 家族, 可利用水解ATP的能量对药物及内源性物质进行转运。 近年来, 随着分子生物学技术的发展, 药物转运体研究取得重大进展。 多种药物已被证明是转运体的底物或抑制剂。 已知LAT的底物包括抗帕金森药左旋多巴,抗癫痫药多巴喷丁。 左旋溶肉瘤素等抗肿瘤药也可抑制肿瘤细胞LAT的活性。 PEPT可识别寡肽及类似结构分子,如β-内酰胺抗生素、抗病毒药伐昔洛韦、血管紧张素转化酶抑制剂福辛普利、肾素抑制剂等均可被PEPT识别而经小肠吸收。 根皮苷、达格列净则可通过抑制SGLT,阻断近曲小管对葡萄糖的重吸收。 OATP1A2的底物包括强心苷类药奎巴因、抗组胺药非索非那定及有机阳离子阿片肽、维库溴铵等。 他汀类、青霉素、甲氨蝶呤、缬沙坦等属于OATP1B1的底物,而环孢素、沙奎那韦、利福平及某些黄酮类化合物可抑制OATP1B1的转运功能。 OCT主要负责转运亲水性、低分子量有机阳离子,其典型底物如二甲双胍及奥沙利铂,抑制剂如奎宁、丙吡胺。 OCT2的典型底物还包括雷尼替丁、阿米洛利和普萘洛尔,甲腈咪呱、西替利嗪均可显著抑制OCT2的转运活性。 P-gp的底物多是疏水性阳离子,维拉帕米、环孢素A可竞争P-gp结合位点,抑制或阻断P-gp的外排功能。 MRP的底物包括多种抗癌药如甲氨蝶呤、依托泊苷、米托蒽醌及血管紧张素受体拮抗剂,环孢素、依法韦仑、恩曲他滨可抑制MRP对底物的外排功能。 BCRP的底物包括普伐他汀及多种植物雌激素,而雌二醇是BCRP的特异性抑制剂。 上述转运体可不同程度地影响药物的吸收、分布、排泄及药物相互作用。 明确药物的转运机制有利于提高药物的安全性和有效性,指导临床合理用药。 因此,转运体在药物研究中的重要性日益引起关注。 本文旨在介绍目前常用的转运体体外、在体及体内研究方法,以期为新药设计、提高药物靶向性及药物相互作用等研究提供借鉴。 体外模型 1 体外细胞模型 体外细胞模型是研究药物转运特性的重要手段,主要包括不含重组转运体的细胞系、原代细胞、三明治培养原代肝细胞模型、转染细胞。 细胞模型在药物发现阶段可用于确定药物是否为单一或多个转运体的底物或抑制剂、药物转运机制及跨膜转运的限速步骤。 此外, 上述细胞体系还可用于转运体介导的药物−药物相互作用研究。 1.1 不含重组转运体的细胞系 来源于不同种属的多种细胞系可用于转运体研究,如Caco-2、MDCK、Caki、IHKE-1、NRK52E、LLC-PK1细胞等。 Caco-2细胞模型被认为是目前最理想的体外吸收模型,可作为快速评估新药吸收和转运特性的方法。 Caco-2细胞来源于人结肠癌细胞,与人小肠上皮细胞结构相似,MDR1、MRP2、PEPT1和OATP-B等多种转运体在Caco-2细胞中表达水平均较高。将药物与Caco-2细胞培养一定时间后测定细胞内药物含量,可反映肠道对药物的吸收。 Shan等采用Caco-2细胞作为药物肠道吸收模型,研究P-gp抑制剂粉防己碱(tetrandrine,Tet)对黄连素(berberine,BBR)的吸收促进作用。 当Caco-2细胞培养体系中同时加入Tet和BBR时,细胞中BBR的蓄积量较单独加入BBR有显著提高,证实Tet可通过抑制P-gp,改善BBR的肠道吸收。 Transwell小室模型可测定药物经细胞的跨膜转运,反映药物肠道转运的渗透性。 将状态良好的细胞接种于Transwell小室聚碳酯膜上,待细胞形成单层后,可通过测定碱性磷酸酶活性或细胞层电阻值等方法检查细胞通透性和完整性,根据公式计算表观渗透系数(Papp)。 通常吸收较差药物(<1%)的Papp<1×10−7cm·s−1,吸收为1%~100%的药物Papp为0.1×10−6~1×10−6cm·s−1,而吸收良好药物的Papp>1×10−6cm·s−1。 Shanmugam等用Caco-2细胞评价促渗透剂对肠道渗透性的改善,提高扎那米韦(zanamivir,ZMR)的生物利用度。 结果表明,在癸酸钠(200mmol·L−1)作用下,ZMR的Papp值高于对照组6倍,肠道渗透性显著提高。 Caco-2细胞模型应用于转运体研究具有诸多优越性,如与人同源性好;易于培养;细胞内含有代谢酶,可在代谢条件下测定药物摄取和跨膜转运等。 此模型应用于预测药物被动转运相关性最为理想,只有部分载体介导主动转运药物可以用该模型预测。 Caco-2细胞模型也存在一定局限性,如Hilgendorf等分别将人肠组织和Caco-2细胞中的转运蛋白表达水平进行定量比较,发现Caco-2细胞中PEPT1、BCRP、MDR1、MRP2的表达水平显著低于人肠组织,因此当应用Caco-2细胞研究以上转运体时应考虑这一因素。 1.2 原代细胞 原代细胞来源于完整组织,可表达存于该组织的全部转运体基因,与体内模型相关性较好,可用于研究药物代谢、转运及临床药物的相互作用。 原代细胞分离后需适应培养环境,以确保细胞适度生长,转运体恰当表达及定位。 原代肝细胞可完整表达肝脏药物代谢酶和转运体,是评价经肝药物转运、代谢及毒性最常用的模型之一。 HepaRG虽然保留了原代肝细胞的许多特征,包括关键药物代谢酶和转运体,但在培养一段时间后会丧失代谢及转运能力。 Ulvestad等研究发现,原代肝细胞OATP1B1的转运活性至少可持续7天,而HepaRG培养2天后OATP1B1丧失活性。 体外评价模型能够长期保持转运及代谢活性十分重要,因此原代肝细胞相对于HepaRG细胞更具优势。 原代肝细胞培养过程中摄取转运体表达较为稳定,而外排转运体表达随培养时间延长有增加趋势,因此该模型多适用于摄取转运体研究。 游离肝细胞培养技术是研究转运体功能的另一重要手段。 将放射性标记底物和抑制剂与肝细胞共同孵育后裂解肝细胞,测定放射强度以反映释出药物的肝细胞摄取率。 Ishiguro等采用大鼠游离肝细胞证实了OATP参与替米沙坦的肝摄取,该过程是Na+依赖性且可被OATP底物兼抑制剂牛黄胆酸盐、普伐他汀和地高辛所抑制,但不能被有机阳离子四乙胺所抑制,说明多种OATPs可能参与替米沙坦的转运,OCTs则不参与。 游离肝细胞模型的特点是可避免其他组织器官对肝细胞的影响,更易控制实验条件。 与肝灌流技术相比,该技术可利用同源肝细胞进行重复实验,即对照组与实验组来源于同一动物,重复性好。 与肝切片相比,游离肝细胞生化特性完整,可保留细胞内代谢酶,避免切片对肝细胞造成的功能损伤。 与亚细胞组分相比,保持了完整细胞的结构,更接近体内环境。尽管具有以上诸多优势,由于失去肝小叶、肝内胆管等结构,游离肝细胞不能完全替代整体动物转运体功能的评价。 脑微血管内皮细胞(brainmicrovascularendothelial cells,BMECs)是血脑屏障(blood brain barrier, BBB)的主要组成部分。 体外培养原代BMECs可保留体内细胞的主要特点,如OATP及P-gp表达丰富,能在体外融合成致密的单层细胞等,因此可用于体外BBB转运体的研究。 Batrakova等用牛原代BMECs细胞作为体外BBB模型,研究普朗尼克嵌段共聚物P85对P-gp底物转运的影响,发现普朗尼克嵌段共聚物P85可显著抑制脑微血管P-gp外排转运功能,增加P-gp底物的转运。 血管内皮细胞在人体多种生理病理过程中发挥重要作用,通常选用原代脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEs)进行转运研究。 Jin等利用HUVEs研究飞燕草素葡萄糖苷(delphinidin-3-glucoside,Dp)通过内皮细胞的转运,发现Dp摄取进入内皮细胞的过程是由钠依赖性葡萄糖转运体(sodium dependent glucose transporter1, SGLT1)介导,且转运过程具有温度、浓度及时间依赖性, SGLT1底物葡萄糖、SGLT1抑制剂根皮苷可显著抑制Dp的转运。 1.3 三明治培养原代肝细胞模型 已知肝细胞中除了含有丰富的药物代谢酶, 还表达多种重要的摄取和外排转运体。 虽然原代肝细胞可模拟肝脏基本功能,然而传统方法培养的肝细胞会迅速丧失极性及代谢能力, 失去胆管网络, 难以模拟体内肝的小管外排功能。 三明治培养是将肝细胞培养于两层胶原之间,底层铺鼠尾胶使肝细胞贴壁, 上层铺Matrigen胶使其形成肝板样结构, 可维持肝细胞极化状态, 保持肝细胞的代谢活性及调节机制, 得以最大程度地模拟肝脏功能。 培养几天后, 肝细胞形成完整胆小管网络并同时保持紧密连接, 且肝脏转运体正常表达并定位于恰当的膜区域, 可用于转运体功能研究。 当细胞在含Ca2+的标准缓冲液中孵育时, 紧密连接体完整, 摄取进入肝细胞的药物可在转运体作用下外排至胆管; 当细胞在无Ca2+缓冲液中孵育时, 紧密连接体遭到破坏, 管腔内药物扩散进入细胞培养液中。 因此, 通过在含Ca2+和无Ca2+条件下测定药物细胞蓄积量的差值可计算排入胆管的药量。 Annaert等采用三明治培养大鼠肝细胞(sandwich-cultured rat hepatocytes, SCRH)研究了P-gp参与的药物胆汁排泄, 以P-gp底物罗丹明123(Rh123)和地高辛作为模型药物, 通过测定有Ca2+和无Ca2+条件下Rh123和地高辛的蓄积量, 确定排入胆管的药量。 在P-gp抑制剂依克立达(GF120918)作用下两药的胆汁排泄率均减小, 且应用SCRH所得的胆汁清除率值与在体大鼠肝灌流、游离肝细胞实验所得数值基本吻合,由此确定P-gp在两药胆汁排泄中的作用。 研究者进一步采用SCRH研究肝脏转运体介导的药物相互作用, 考察P-gp调节剂对Rh123胆管外排指数(BEI)、胆汁清除率(CLbile)的影响。 通过比较有无调节剂的BEI和CLbile值可推断转运相互作用发生在基底侧还是胆小管膜, 进而阐明肝脏药物转运相互作用的潜在机制。 P-gp诱导剂地塞米松(10μmol·L−1)可使CLbile显著提高而BEI值不变,说明地塞米松对P-gp的诱导发生在基底侧,而诱导剂利福平(5~50μmol·L−1)可同时提高BEI和CLbile,提示利福平对P-gp的诱导发生在胆小管膜侧。 与目前常用的MDR1-MDCK、Caco-2等单层细胞模型相比,SCRH模型能更好地模拟体内环境,可同时考察转运体与药物代谢酶的相互作用。 用于预测药物胆汁排泄以及基于转运体的药物相互作用,并可与动物体内试验结果进行相关分析。 1.4 转染细胞 将重组转运体基因稳定或瞬时转染于不同细胞系,可用于研究转运体功能及药物相互作用。 转染细胞系可单独表达吸收和外排转运体,或者二者共表达。 用于构建转染细胞的细胞系众多,如MDCK、HEK239、LLC-PK1和CHO细胞系等。 构建过程包括将含目的基因片段的重组质粒转染至特定细胞,用G418进行筛选,挑选单克隆细胞后结合 Western Blot、PCR、免疫荧光显微镜或放射性标记底物摄取/外排率等方法验证转染细胞是否构建成功。 Yang等分别用OAT4、OATP1A2、URAT1基因转染CHO及HEK293细胞,成功构建OAT4/CHO、OATP1A2/HEK293、URAT1/HEK293细胞模型, 研究3种转运体对底物全氟辛酸(pentadeca fluoro octanoic acid,PFO)的转运,发现OAT4和URAT1可参与PFO的吸收。 除了单转染细胞系,稳定转染双转运体的极化细胞目前也得到广泛应用,如在细胞基底侧膜转染吸收转运体,在基顶侧膜转染外排转运体。 König等构建了MDCK-OCT1-MATE1、MDCK-OCT2-MATE1双转染细胞模型,并用相应的单转运体转染细胞作为对照,研究二甲双胍和甲基−苯基−吡啶阳离子(MPP+)的转运机制,证实OCT1、OCT2介导两个药物的摄取转运,而MATE1介导外排。 上述方法不但能考察介导每种底物转运的转运体,同时可研究多种转运体的相互作用。 一般认为,单转染细胞通常缺乏内源性吸收或外排转运体,无法模拟药物分子跨膜转运的完整机制,而双转染细胞在一定程度上克服了这一缺陷。 然而在完整器官中,某些化合物的转运可能是由多种转运体所介导, 即使双转染细胞也无法全面预测体内转运的真实过程, 进而有研究者构建了三重转染细胞,如Hirouchi等构建的OATP1B1/MRP2/MRP3、OATP1B1/MRP2/MRP4三转染细胞用于研究药物经过转运体的矢量转运。 对某些药物而言,药物相互作用的产生不仅来自转运体,而是药物代谢酶和转运体的共同作用,如外排转运体和CYP3A4协同降低共同底物的吸收。 Kwatra等构建了P-gp和CYP3A4双转染的MDCK细胞系(MMC), 两种基因的表达及功能验证表明MDCK细胞适用于同时表达这两种基因, 并用该细胞系验证P-gp及CYP3A4协同发挥作用限制共同底物的吸收。 双转染细胞系由于保留了转运体和代谢酶的高度协同作用,对转运体和药物相互作用的研究具有更高价值。 2 基于膜的体外模型 2.1ATP酶测定法 ATP水解法可用于研究某些底物和抑制剂与ABC转运体的相互作用。 ABC转运体需要利用ATP分解产生的能量进行物质转运, 因此将底物分别与含P-gp、MRP、BCRP转运体的细胞或组织温孵, 利用比色法测定转运过程中ATP裂解产生的无机磷酸盐, 可以反映药物转运机制。 此种分析方法简便易行, 可应用于高通量筛选, 批量分析与ABC转运体相互作用的化合物。 该技术的缺点包括:对某些底物和抑制剂来说, ATP酶的活性与转运速率不一致;容易出现假阳性或假阴性结果;底物需要较高的浓度。 故该法一般不单独应用于ABC底物或抑制剂的筛选。 2.2 膜囊泡转运模型 该模型将膜囊泡混悬于含药缓冲液中,模拟药物吸收,包括刷状缘膜囊泡(BBMV)、基底膜囊泡和外翻转囊泡模型。 BBMV法是将禁食动物小肠取出,沉淀离心处理肠细胞匀浆,得到的沉淀物具有刷状缘酶和载体活性。 将所得沉淀物重新混悬,得到囊泡,测定囊泡摄取的药物,模拟药物吸收。 Liu等采用家兔BBMV模型证实抗肝炎药JBP485及其衍生物JBP923均能抑制PEPT1典型底物甘氨酰肌氨酸的转运,故这两个化合物在肠道的转运也是由PEPT1所介导。 BBMV和基底膜囊泡联合应用, 可以同时研究肠细胞顶侧膜和基底膜的转运。该方法实验时间短, 囊泡制备方便,适合新化合物早期高通量筛选。 外翻转膜囊泡模型主要用于外排转运体的研究, 尤其是ABC转运体。 囊泡外翻后, 转运体暴露在囊泡表面, 与药物共同温孵时, 转运体可以将药物转运到囊泡内, 测定囊泡内药物含量可反映转运体对药物的作用。 多种细胞可用于制备膜囊泡, 如转染细胞及杆状病毒感染的昆虫细胞。 采用外翻转膜囊泡模型进行研究时, 分析体系需含有ATP再生系统以维持分析期内能量持续供应, 且应采用5'-AMP替代ATP的体系作为阴性对照。 与转染细胞模型相比, 该模型除减少了细胞培养步骤、操作简便外, 更主要的优点是如果化合物分子量大、不易透过细胞膜时, 细胞模型将无法研究药物的转运机制, 而外翻转膜囊泡模型则不受化合物渗透性的影响。 此外, 药物直接作用于外翻转膜上的转运蛋白, 可检测药物的吸收而非外排, 计算吸收动力学参数, 用于目标转运体底物或抑制剂定量构效关系分析(quantitative structure activity relationship,QSAR)。 值得注意的是,该方法不适用于研究疏水性底物的转运,因该类化合物易与囊泡或细胞内的膜结构结合,导致背景增高。 在对疏水性底物进行囊泡转运分析时,需先应用不同的排阻技术以减小背景干扰。 3 肾切片摄取模型 肾切片摄取模型是将麻醉大鼠肾脏取出,切成厚度约为300μm的切片,将该切片置于通氧的水浴中温孵,加入待测药物,测定摄取药量。 Liu等静脉注射顺铂诱导大鼠急性肾衰竭,应用肾切片模型研究JBP485改善急性肾衰竭的作用。 研究可见,大鼠静脉注射顺铂后,血中对氨马尿酸(para-amino hippurate,PAH)含量显著升高,PAH的AUC和t1/2分别是对照组的2.2倍和1.9倍,肾切片实验结果显示PAH摄取显著降低。 顺铂诱导大鼠给予JBP485后可降低肌酸酐、血尿素氮,恢复肾小球滤过率,促进毒性代谢产物排出。 qRT-PCR和Western-blot测定证实顺铂诱导大鼠OAT1、OAT3表达减少,且MRP2表达量增加,而给予JBP485后MRP2表达量进一步增加,提示JBP485通过上调外排转运体,促进毒性代谢产物排出。 肾切片模型可研究药物是否为肾脏转运体的底物,预测化合物的肾转运特点。 该方法的局限性在于仅能考察肾脏分泌型转运体,由于缺乏完整的肾小管网络,不适于重吸收转运体的研究。 4 外翻肠囊模型 外翻肠囊模型是由刷状缘膜囊泡和体外小肠肠环培养技术发展而来。 将大鼠麻醉后分离小肠, 用缓冲液将小肠洗净, 外翻, 使肠粘膜暴露在外侧,结扎小肠末端。 分离得到的肠段可采用乳酸脱氢酶法或台盼蓝法对肠粘膜细胞活性进行评价。 在肠腔内加入培养液,将肠段放入含有药物的培养液中, 持续通氧培养一定时间后, 取培养液测定药物浓度, 以肠囊内外药物浓度变化反映肠道转运体的参与程度。 Hamilton等应用外翻肠囊法对SGLT1进行了系统研究, 包括SGLT1的Na+依赖特性、抑制剂及Na+-K+-ATP酶在转运过程中的作用。 研究发现,SGLT1是一种典型的继发型转运体,利用Na+进入细胞产生的电化学梯度引起细胞内葡萄糖蓄积,而Na+电化学梯度的产生和维持依赖于Na+-K+-ATP酶。 该方法实验条件易控,操作简单,经济实用且重复性好,被广泛应用于转运体转运机制、营养物质吸收及药代动力学的研究。 由于缺乏体内肠蠕动状态、血液供应和消化道细胞代谢特性,用该方法所得的结果与体内生理状态仍存在一定偏差。 在体模型 目前广泛应用的动物在体肝、肠及脑灌流模型可分别用于肝脏、肠道、脑部转运体的研究。 在体器官灌流模型通过在灌流液中加入转运体的选择性抑制剂, 比较灌流液、组织器官或血浆中药物含量的差别, 考察转运体对药物的吸收或外排作用。 通过比较单个或多个药物联合灌流的结果, 可研究合用药物对同一转运体的竞争而影响药物吸收。 1 在体肠灌流模型 禁食大鼠胆管结扎并分离肠段,将插管与肠端相连并结扎,灌流管与插管连接后进行在体肠段灌流。 用含药灌流液进行灌流后不同时间点采集肝门静脉血测定药物浓度。 肠灌流可保持血液供应、肠道药物代谢酶的活性、神经及内分泌的完整性,可较好反映生理条件下药物在肠道吸收。 Zhang等采用大鼠在体肠灌流模型发现JBP485与头孢氨苄(OATP底物)合用后较单独给药在门静脉内浓度降低,证实两药合用后由于竞争OATP而影响了药物吸收。 2 在体脑灌流模型 脑灌流模型用于研究药物经BBB及血眼屏障的转运机制,灵敏度极高,不但保持了器官的完整性、生理条件下的位置及状态,且避免了药物与血浆蛋白的结合及外围器官的代谢。 该技术通过直接向通往脑部的颈动脉灌流,待测物质以已知浓度加入到灌流液中,测定进入脑内药量,计算相关参数,分析药物脑部转运特征。 脑灌流模型手术完成后需以14C或3H标记的蔗糖进行短暂灌流,以检测BBB的完整性并计算血管容量。 Tournier等采用小鼠在体脑灌流模型评价了ABC和OATP转运体对格列苯脲(glyburide,GLB)转运的贡献。 灌流液中同时或单独加入P-gp、BCRP、MRP及OATP抑制剂的研究发现,P-gp及BCRP协同限制GLB入脑,另外可能还存在MRP4的外排转运,而OATP不参与GLB的转运。 3 在体肝灌流模型 大鼠在体肝灌流不影响药物被其他器官的代谢和消除,是一种评价药物转运过程的理想模型。 You等采用大鼠在体肝灌流模型研究MTC-220在肝脏的转运机制, 当灌流液中加入OATP抑制剂利福平时, MTC-220的肝脏摄取率与对照组相比显著降低, 当灌流液中分别加入丙磺舒(MRP2抑制剂)、新生霉素(BCRP抑制剂)及维拉帕米(P-gp抑制剂)时, MTC-220的胆汁排泄率显著降低, 提示OATP可能涉及MTC-220的肝脏摄取,MRP2、BCRP及P-gp可能参与MTC-220的外排。 体内模型 1 基因敲除小鼠 Schinkel等[28]采用转基因技术构建了mdr1a(−/−)小鼠,该种小鼠无明显生理缺陷,但不表达P-gp。 mdr1a(−/−)小鼠限制药物脑部暴露量, 作用高于P-gp抑制剂伊维菌素100倍。 此后基因敲除动物模型种类日益丰富,商品化应用逐渐完善, 成为目前研究转运体功能的重要工具之一。 为证实P-gp及BCRP对共同底物的透过具有协同作用, Kodaira等将P-gp底物奎尼丁给予Bcrp(−/−)小鼠, BCRP底物丹曲林给予Mdr1a/1b(−/−)小鼠, 与野生型小鼠比较两药的脑、睾丸与血浆的浓度比(Cbrain/Cplasma,Ctestis/Cplasma)。 结果显示,P-gp、BCRP的单独缺失不会引起丹曲林或奎尼丁Cbrain/Cplasma、Ctestis/Cplasma明显改变, 即不会影响BCRP、P-gp外排功能。 研究者进一步采用双基因敲除小鼠研究P-gp和BCRP共同底物埃替特罗、夫拉平度及米托蒽醌的外排作用, 3种底物在Mdr1a/1b(−/−)/Bcrp(−/−)小鼠体内的Cbrain/Cplasma及Ctestis/CplasmaMdr1a/1b(−/−)、Bcrp(−/−)小鼠有明显提高。 由此可见, P-gp及BCRP在介导底物外排方面具有协同作用, 当某一转运体单独缺失时,不会引起底物外排率的明显改变。 此外, 将各基因型缺陷小鼠的Cbrain/Cplasma及Ctestis/Cplasma分别与野生型进行比较,P-gp对共同底物的外排贡献大于BCRP。 基因敲除小鼠用于转运体的研究具有以下特点: ①可阐明生理条件下的转运体功能,如对主要血液−组织屏障的保护作用; ②无需抑制剂即可研究转运体对药物的摄取和外排; ③可用于多转运体协同作用的研究。 但其存在问题也需注意。 已有研究者对Mdr1a、Bcrp及Mrp2基因敲除小鼠在小肠、肝、肾、脑组织的基因表达及病理学改变进行了系统研究。 结果显示, Mrp2基因敲除小鼠表现出高胆红素血症及肝脏Mrp3上调, 小鼠肝细胞体积增大, 清除器官重量增加会导致药物清除增加。 因此, 在应用基因敲除小鼠进行转运体功能研究时, 基因敲除引起小鼠代偿性功能改变进而导致药物代谢动力学的变化需引起关注。 此外, 基因敲除模型种类有限、价格昂贵及种属间差异,使得该技术难以应用于转运体底物及抑制剂的高通量筛选。 随着研究者对转运体功能研究的重视, 会有更多类型的转运体基因敲除动物模型出现,进一步促进药物转运的研究。 基因敲除动物模型是研究缺失转运体的转运机制及药物在组织中富集、药效发挥的理想模型,对于寻找新的转运体抑制剂也十分有用。 2 抑制剂“敲除”转运体 体内实验方法除采用普通动物与基因敲除动物作对比实验外, 也常用选择性抑制剂抑制转运体功能,达到“敲除”转运体的目的, 考察药物在抑制剂组和对照组动物体内吸收和代谢差别,从整体动物水平研究转运体对药物的作用。 Matsuda等采用P-gp和BCRP的特异性抑制Zosuquidar(ZSQ)、Ko143研究了P-gp及BCRP共同底物拓扑替康(topotecan, TPT)的转运机制及单个转运体对TPT转运的影响。 结果显示,BCRP对TPT的外排能力是P-gp的3倍。 用抑制剂“敲除”转运体是一种方便快捷的研究转运体的方法,但存在抑制剂特异性不高,价格较高等问题,未来的研究中还需开发特异性高且价格相对便宜的抑制剂。 3 小动物活体成像技术 动物活体成像技术是在不损伤动物的前提下,应用影像学方法对生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性定量研究。 该技术主要分为核素成像、光学成像(opticalimaging)、计算机断层摄影(computed tomography,CT)、核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)和超声(ultrasound)成像。 其中光学成像和核素成像的灵敏度和精确性极高,特别适合研究药物代谢和转运等生理过程,称为功能成像。 核素成像是用放射性核素示踪的方法显示体内结构,按所用核物理探测方法不同分为正电子发射断层显像(positron emission tomography,PET)和单光子发射断层显像(single photon emission computed tomography,SPET)。 研究肿瘤细胞中BCRP及P-gp功能时,PET技术较为常用。 Yamasaki等将高表达BCRP及P-gp的Caco-2细胞导入小鼠体内,在抑制剂存在或缺失的情况下应用PET扫描,比较BCRP与P-gp共同底物[11C]GF120918的摄取率。 当给予抑制剂时,[11C]GF120918的摄取率显著提高,由此证实GF120918在肿瘤细胞中的转运是经P-gp和BCRP转运体所介导。 体内光学成像包括荧光与生物发光两种技术。 荧光技术采用荧光染料(包括荧光量子点)或荧光报告基因(GFP、RFP)等纳米标记材料进行标记,利用荧光蛋白质或染料产生的荧光、报告基因产生的生物发光可形成体内生物光源。 Pichler等采用RNAi技术下调肿瘤细胞中P-gp的表达,用P-gp底物海肾荧光素酶作为成像探针,应用荧光成像技术观察到海肾荧光素酶在肿瘤细胞中的摄取率高于对照组4倍。 可见光成像具有无辐射、使用低能量、实时监测活体生物体内细胞活动和基因行为,对信号检测灵敏度高等优势。 随着可见光成像技术的迅速发展,成像探针不断更新,在药物转运体研究中的应用会更加广泛。 结 语 体内存在的转运体对药物跨膜转运起决定作用,可影响药物的体内过程及药物间相互作用。 本文将目前常用的转运体研究技术进行分类介绍并归纳各自优缺点(表1), 研究者在对某一转运体进行研究时需综合考虑各方面因素, 选取适合的方法。 表 1 转运体研究方法及其优缺点比较 由于体内转运机制复杂,影响因素很多, 采用单一方法了解某一或某些转运体的功能是不够的,往往需要权衡各类方法的利弊, 多种方法联合应用, 所得结果相互佐证,综合分析及验证。 随着新药研发新技术的出现、分子生物学及计算机技术的发展,会有更多、更高效、灵敏的转运体研究方法出现, 对了解新化合物的体内过程、结构修饰、转运体所介导的药物相互作用、提高药物生物利用度、降低药物不良反应及临床合理用药提供更为全面科学的依据。 来源:药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2014, 49 (7): 963−970 IPHASE/汇智和源致力于为创新药研发企业及生命科学研究机构提供高品质的生物试剂,主要产品包括ADME产品,空白生物基质,遗传毒性试剂,磁珠分选试剂盒,原代细胞,重组蛋白,抗体等。
人CD3+T淋巴细胞阳性分选原理及注意事项 2022-01-14
人CD3+T淋巴细胞阳性分选原理及注意事项 一、细胞分选方法概述 细胞学研究中一个很重要的课题就是细胞的分离纯化,尤其是需要对某种特定的细胞进行功能研究,如对细胞培养上清液通过ELISA分析检测细胞因子、细胞共培养检测细胞功能等,都需要得到高纯度的目的细胞。因此,高效地分离所需要的目的细胞是进行细胞功能研究的先决条件。 细胞分选(cell sorting)是指根据细胞所具有的特性把某种特定的细胞亚群从混合的细胞样品中分离出来的一种技术,它是对某一特定细胞进行生化分析和功能分析的前提和基础。常用的细胞分选方法主要有两大类:一类是基于细胞物理性质的密度梯度离心法(Density gradient centrifugation),另一类是基于免疫识别特性的方法,包括荧光激活细胞分选方法(Fluorescence-activated cell sorting,FACS)和磁性激活细胞分选法(Magnetic-activated cell separation,MACS)。 密度梯度离心法是基于不同的细胞群之间存在沉降系数差异的原理建立起来的,在一定的离心力的作用下,不同种类的细胞会以各自不同的速度沉降,在密度梯度不同的区域上会形成区带。这种方法简单易行,但此种方法分离所得到的细胞纯度较低,且细胞表面的标志不明确,特异性较差,目前使用较少。 流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是20世纪60年代后期发展起来的一种利用流式细胞仪(Flow cytometer)进行快速定量分析细胞亚群的物理化学特性,根据这些物理化学特性精确分选细胞的新技术,FCM主要包括流式分析和流式分选两部分。FACS最初于1972年提出,是指荧光驱动的细胞分选新技术,即利用分选型流式细胞仪分选标记有荧光素偶联抗体的细胞样品,通过荧光系统区分目的细胞和非目的细胞。流式细胞仪通过接受激光照射后液流内细胞的散射光信号和荧光信号反映细胞的物理化学特性,如细胞的大小、颗粒度以及抗原分子的表达情况等,目前已被广泛应用于生命科学及其相关领域的基础研究。流式细胞分选被认为是细胞分选的“金标准”,它分选所得的细胞纯度高、回收率高、且操作环境为全封闭型,不易被污染。但是,该方法所需设备比较昂贵,耗时,且需要高水平的技术支持以及专业的操作人员;且该方法在一段时间内只能分选一个细胞样品,若试验需要从不同的样品中分选目的细胞时这种方法不可行;同时,由于FACS对细胞刺激较大,因此对分选出的细胞活性有较大影响。    磁性细胞分选(MACS)是20世纪70年代发展起来的,是用结合有抗体的免疫磁珠与样品细胞进行孵育,表达有相应抗原的细胞就会特异性的结合在包被有抗体的免疫磁性微粒上,当体系缓慢的经过磁场时,带有磁珠的细胞就会滞留在磁铁上,而非目的细胞由于未结合磁珠仍存在与混合细胞悬液中,从而达到分离纯化细胞的目的。MACS法是一种相对高效简便的细胞分选方法,所需设备简单,只需一块专用磁铁即可进行分选,操作较为简单,对操作人员的技术要求也不高,一般实验室都可进行磁性分选。磁性分选只是让细胞处于一个低磁场中,基本可以忽略对细胞的影响,分离得到的细胞具有较高的复苏率及细胞活性,对于下游应用影响较小,在保持细胞活性方面优于流式分选。磁性分选因其高灵敏度、高纯度、易操作、对目的细胞刺激较小等特性成为了细胞分选的首选方法,具有潜在的应用前景。 二、免疫磁性细胞分选 2.1 原理 磁性细胞分选是基于免疫学中抗原抗体之间特异性结合的原理进行的。以磁性微粒作为载体,对其进行抗体或亲和配体包被,形成免疫磁性复合微粒,当其与混合细胞孵育后,磁性微粒表面抗体会与细胞表面的抗原决定簇发生抗原抗体的特异性反应,使得细胞被磁性复合微粒标记。在外加磁场的作用下,抗体与磁珠相连的细胞会因磁珠的磁性而滞留在磁场中,而不表达此抗原的细胞因不能与磁珠表面的特异性抗体结合而没有磁性,不能够在磁场中滞留,从而使目的细胞与非目的细胞分开,得到较高纯度的目的细胞。   图1 免疫磁性细胞分选原理示意图 2.2 免疫磁性细胞分选系统的分类 根据不同的分类标准,可以将免疫磁性细胞分选系统分为不同种类。 2.2.1 依据所标记细胞的不同分类 根据分选过程中所标记细胞类型的不同将免疫磁性细胞分选系统分为阳性分选、阴性分选和复合分选。 阳性分选(IPHASE人CD3+T细胞阳性分选试剂盒),即将目的细胞亚群直接从细胞悬液中分离出来。通过磁珠包被目的细胞的特异性抗体与混合细胞悬液孵育,在抗原抗体发生特异性结合后,通过磁分离方式,将目的细胞分离出来。 阴性分选,即从多细胞悬液中分离去除非目的细胞而得到目的细胞的一种方法。此方法的优点在于整个分选过程中目的细胞都未与磁珠(IPHASE SA磁珠)结合。由于抗原抗体的结合可能会引起细胞膜表面的信号传递,因此,此法具有较大的优势。但同时此方法也有不足之处,当靶细胞的细胞数所占细胞比例较小时,分选过程中存在的非特异性吸附会直接导致目的细胞的损失,此外,非目的细胞未被充分去除等,都会使得细胞的分选效率和分选纯度较低。 复合分选是指联合使用两种以上的分选策略进行分选,这种方法主要用于细胞亚群的分选或者想要分离得到高纯度的稀有细胞。 2.2.2 依据分选方法的不同分类     根据分选方法的不同可以将免疫磁性细胞分选分为直接分选法和间接分选法。 直接分选法是指将抗体或者亲和配体直接包被在磁性颗粒上,形成免疫磁性复合微粒,将其与多细胞悬液混合孵育之后,目的细胞会特异性的结合在免疫磁珠上,在外加磁场作用下,带有磁珠的目的细胞会滞留在磁场中,而非目的细胞则会被去除。 间接分选法分选细胞引入了二抗,即将目的细胞首先与对应的一抗孵育,激活细胞,之后清洗出去未结合的一抗,然后加入预先包被有二抗的磁性颗粒与活化后的细胞孵育,一抗与二抗之间的相互作用会导致磁粒结合在目的细胞上,同样在磁场作用下滞留目的细胞,达到分选的目的。 2.2 免疫磁性细胞分选系统的组成 免疫磁性细胞分选系统主要有磁性微粒、待标记抗体、磁性分离器(磁力架)、缓冲体系等组成。其中,磁性微粒的选择是分选成败的关键。 磁性微粒是指具有磁性或超顺磁性的粒子、磁性胶质体、磁性脂质体等。较为常见的磁性物质为Fe3O4或γ-Fe2O3磁性微粒;也有二氧化铬和铁素体的磁性微粒。应用于细胞分选的磁粒(IPHASE SA磁珠)具有非常严格的标准,其化学性质必须稳定,分散性好,在细胞悬液中不团聚,去掉外加磁场后没有磁滞现象,且不能吸附非特异性细胞,磁粒储存过程中亲和配体不能掉落,分选过程中可迅速、完全的被磁性分离,并可最大限度地减少细胞的吞噬作用。 磁性微粒的粒径大小对于细胞分选具有很关键的作用,因为粒径直接决定了磁粒的物理性质与可操作性。粒径较大的磁粒(>1μm)和粒径较小的磁粒(50~200nm)在细胞分选中都有广泛的应用。在某些情况下,不同的实验要求需要使用不同特性的磁粒。磁粒粒径的大小与其标记细胞的能力有很大关系,粒径大的磁粒可以负载更多的标记细胞接受部位。并且,细胞分选过程中,标记了较大磁粒的细胞,更容易被磁性分离器吸附,对磁性分离器的要求较低,简单、便宜、磁场强度较低的的磁分离器就可以满足要求。标记物或小分子标记物标记的粒径小的磁粒,却需要昂贵高强度的磁性分离器才能成功分选靶细胞。 2.3 免疫磁性细胞分选的过程 磁性细胞分选过程分为磁性标记及磁性分离两个过程。从复杂样品中分选靶细胞的流程大致分为三个步骤: 第一步,磁性标记物与含有靶细胞的细胞悬液混合孵育。孵育过程中,靶细胞与标记物相互作用,通过磁性分离把磁性标记物-靶细胞偶联产物与其它细胞分离。 第二步,清洗磁性标记物-靶细胞复合物,去除杂质。在这个过程中,可直接将磁性复合物-靶细胞复合物用来进行细胞培养,也可以裂解细胞,通过色谱分析、电泳或等方法分析细胞内容物。 第三步,磁性标记物与靶细胞的分离、移除。将磁性标记物与靶细胞分开,通过磁性分离去除磁性标记物,释放靶细胞,以便后续实验的进行。 2.4 免疫磁性细胞分选应用 作为细胞生物学研究的前提和基础,细胞分选技术已经得到了广泛的应用。随着细胞分选技术的不断发展,免疫磁性细胞分选技术已越来越受到研究者的的认可,目前已有许多商业化的试剂盒和分选磁珠(IPHASE SA磁珠)应用于细胞亚群的分选。最常见的为从人的外周血中分离细胞亚群,如B淋巴细胞、T淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、自然杀伤细胞等。 2.5 免疫磁性细胞分选效果的评价 细胞分选效果的评价指标主要包括分选纯度和分选得率。 分选纯度是指被分选出所有细胞中目的细胞所占的百分比。 分选得率是指被分选出来的细胞数与原混合细胞悬液中该种目的细胞数的百分比。 三、人CD3+T淋巴细胞免疫磁性细胞分选 3.1 CD3+T淋巴细胞概述 免疫细胞(immune cell)是白细胞的俗称,包括淋巴细胞和各种吞噬细胞等,也特指能识别抗原、产生特异性免疫应答的淋巴细胞等,淋巴细胞是免疫系统的基本成分。 淋巴细胞包括T淋巴细胞(CD3+)、B淋巴细胞(CD3-CD19+)、NK细胞(CD3-CD16+CD56+),其中T淋巴细胞是淋巴细胞的主要组成。 T淋巴细胞是胸腺依赖淋巴细胞(thymus dependent lymphocyte),简称T细胞。CD3+T淋巴细胞代表全T淋巴细胞,包括辅助/诱导T淋巴细胞(CD3+CD4+)、抑制/细胞毒T淋巴细胞(CD3+CD8+)、CD4+T细胞纯真亚群(CD4+CD45RA+/ CD4+CD45RA+62L+)和记忆亚群(CD4+CD45RA-/ CD4+CD45RO+)、功能亚群(CD28+)、激活亚群(CD38+、HLA-DR+)、凋亡亚群(CD95+)等。 3.2人CD3+T淋巴细胞分选试剂盒简介 IPHASE/汇智和源顺应市场需求,推出了可用于人CD3+T淋巴细胞分选的试剂盒,助力于生命科学的研究。根据分选样品的不同,分为适用于人PBMC样品分选和适用于人全血样品分选的两种试剂盒。试剂盒操作简单便捷,各成分对细胞无毒性,且可实现高纯度细胞分离的目的,为下游实验提供便捷。 3.3 试剂盒特点 l 便捷性 只需一步操作,即可实现高纯度细胞分选。 l 高效性 分选得到目的细胞最短只需15min。 l 高纯度 细胞分选纯度可达95%以上。 l 高活性 细胞分选后目的细胞存活率高。   图1 图1为使用人CD3+T细胞阳性分选试剂盒分离人全血后,使用克隆号为HIT3a的人CD3-FITC流式抗体进行染色后,经流式细胞仪分析结果。左图为未经分选流式图;右图为经阳性分选后的流式图。   3.4试剂盒原理 采用免疫磁珠阳性分选的方法,利用偶联于磁性微粒上人CD3单克隆抗体的高度特异性,使磁珠特异性结合PBMC(人外周血单个核细胞或脐带血单个核细胞)中的CD3+ T细胞,通过外加磁场的作用,使得CD3+ T细胞得以滞留在磁场中而被分离出来。   4.3试剂盒组成 产品组成 产品规格 Human CD3 Magnetic Beads 20test 200test Selection Buffer 50mL 500mL   4.4 试剂盒分选流程    
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