400-127-6686
support@iphasebio.com
生命科学
酶联免疫吸附测定
流式细胞术
细胞分选
细胞培养
酶联免疫吸附测定

酶联免疫吸附测定 (ELISA) 是一种广泛应用于生物学和医学科学的免疫酶技术,用于定量测定各种生物基质样品中的抗体、抗原、糖蛋白、糖脂等分子。ELISA检测法依赖于抗原-抗体相互作用,结合酶/底物的催化作用,可以特异性识别复杂生物基质中目标分子。目前主要有4种形式的 ELISA 方法,包括直接 ELISA检测法、间接 ELSIA检测法、夹心 ELISA检测法和竞争性 ELSIA检测法。无论采用哪种形式,重要的是选择合适的固定抗原或捕获检测抗体对,以确保方法的特异性和灵敏度。

流式细胞术

流式细胞技术 (FCM) 是利用流式细胞仪将单个细胞传送通过光测量点,经不同波长的散射光,检测到具有荧光标记抗体(和细胞表面抗原组合)的细胞,并在细胞图上记录出来。 FCM 的优势是在于可以在短时间内(几十秒到几分钟)测量大量单个细胞,从而可以揭示细胞群的异质性,并且可以识别、量化和分类不同的细胞亚群以供进一步研究。 FCM越来越多地应用于细胞周期、细胞生理学、免疫表型等研究领域。

细胞分选

磁性细胞分选技术是利用磁性粒子偶联识别细胞表面抗原的高特异性抗体分离特定亚群的活细胞。基于磁场的磁性选择和抗体-抗原的相互作用,将目标细胞从血液或组织中分离出来。该技术被广泛用于从人和动物组织或血液样本中分离全T细胞、CD4+T细胞、单核细胞、B细胞、干细胞、NK细胞、树突细胞、内皮细胞、肿瘤细胞、白细胞、粒细胞等。特定的细胞亚群从磁珠中释放出来,几乎不受任何损伤,可直接用于细胞培养、流式细胞术和基于细胞的检测等下游应用。

细胞培养

细胞培养技术使得在实验室内体外模拟细胞分化和代谢功能成为可能。

原代细胞是从人类或动物供体组织中直接分离出来的细胞,已高度分化且接近起源组织,但通常不具有增殖性。而永生化的细胞系是从肿瘤或组织中分离出来的、可在体外培养并稳定增殖的细胞,但通常在遗传学和表型上与其起源细胞存在较大的差异。

就培养方法而言,多数源自组织的细胞,比如胚胎 (hESCs) 和间充质干细胞、纤维细胞或肝细胞,需要在细胞培养瓶或多孔板或滚瓶的表面贴壁生长。贴壁培养的细胞增殖受到培养容器的可用表面积的限制。血液细胞系或经驯化后的一些组织细胞也可在摇瓶中悬浮生长。经改造的工程细胞系可悬浮培养于生物反应器中,用于大规模生产生物类药品。

应用科学
药物筛选
遗传毒性研究
生物分析
室间质评与能力验证
药物筛选

新药开发过程通常包括临床前研究、临床试验、报批和生产上市4个阶段。药物代谢研究在新药开发的前两个阶段具有重要的指导意义,尤其是在代谢信息不明确的开发早期。

通过利用各种体外代谢模型对候选化合物的代谢特性(如代谢稳定性、代谢产物生成、代谢表型、酶抑制IC50等)进行高通量筛选,可以对代谢过快或生成毒性代谢物的候选化合物进行结构改良,或通过合成活性代谢物或模拟活性代谢物的结构得到新的候选化合物。

与体内代谢研究相比,体外代谢研究可在新药研发早期利用候选化合物的体外代谢参数合理预测候选化合物的体内药动学行为,指导后期药效、药动以及安全性评价的模型选择,缩小体内研究的筛选范围。

遗传毒性研究

遗传毒性研究(Genotoxicity Study)是药物非临床安全性评价的重要内容,与其他研究尤其是致癌性、生殖毒性等研究有着密切的联系,是药物进入临床试验及上市的重要环节。拟用于人体的药物,应根据受试物拟用适应症和作用特点等因素考虑进行遗传毒性试验。遗传毒性试验是指用于检测通过不同机制直接或间接诱导遗传学损伤的受试物的体外和体内试验,这些试验能检测出DNA损伤及其损伤的固定。

遗传毒性试验方法有多种,根据试验检测的遗传终点,可将检测方法分为三大类,即基因突变、染色体畸变、DNA损伤;具体的试验内容包括细菌回复突变试验(Ames试验),体外染色体畸变试验,体外微核试验,体外小鼠淋巴瘤L5178Y细胞TK基因突变试验,HGPRT基因突变试验,彗星试验等。

IPHASE品牌针对遗传毒性各项试验,分别开发出遗传毒性Ames试剂盒,体外染色体畸变试剂盒,体外微核试验试剂盒,TK染色体畸变试剂盒,HGPRT基因突变试剂盒,彗星试验试剂盒等,大大提高各个遗传毒性试验的完成效率,省去试验试剂配制准备验证等各个环节,大大缩短实验人员实验时间。

生物分析

质谱检测中,不可避免的会遇到基质效应,为了验证基质带来的影响,需要使用空白基质,若分析物为外源性物质(大多数药物,环污染物等)都可以使用正常人或动物的生物样品(血浆,血浆,尿液,胆汁等)作为正常的BLANK,单如果分析物为内源性物质(正常人或动物体内本身含有的皮质醇,胆红素,维生素等),就很难获得空白基质,这种情况下,想要去除生物样本中的内源性物质很难完成,可以使用人工基质,模拟人体或动物体内环境配置而成,成分明确,有效解决内源性物质干扰问题。

IPHASE品牌空白生物基质产品,包括不同种属动物空白血清,血浆,尿液,胆汁,粪便,组织等空白基质,人工血浆,人工尿液,人工胃液,人工小肠液等人工基质,为创新药物研发机构生物分析研究,大分子药物生物分析,小分子药物生物分析,如方法学开发,方法学确证,药代动力学分析,毒代动力学分析等提供专业产品与专业服务。

室间质评与能力验证

室间质量评价也被称作能力验证,是国际公认的临床实验室全面质量管理的重要组成部分,也是医疗机构质量管理的重要内容。室间质量评价是为确定某个实验室进行某项特定校准或检测能力以及监控其持续能力而进行的一种实验室间的比对。

IPHASE拥有专业的综合分子检测平台,十余年分析检测经验,长期为中国疾病预防控制中心,国家食品安全风险评估中心,卫健委临床检验中心,北京市临床检验中心提供能力验证相关标准物质与质控品。

技术应用:
高效CD3/CD28刺激磁珠上线啦! 2022-08-15
目前,体外模拟T细胞活化的双信号作用,联合使用CD3和CD28抗体刺激T细胞,是进行T细胞激活和扩增最广泛的方法。针对T细胞激活与扩增,汇智和源研发团队研制以免疫学为基础以及纳米磁珠技术为核心,研制出能够高效刺激T淋巴细胞增值的免疫磁珠产品。 图1:IPHASE CD3/CD28 beads 刺激淋巴细胞原理 IPHASE CD3/CD28 beads分离刺激人淋巴细胞流程 图2:IPHASE CD3/CD28 beads 分选刺激淋巴细胞扩增流程 IPHASE CD3/CD28 beads刺激T淋巴细胞增值培养3天后,开始形成细胞簇。 IPHASE CD3/CD28 beads分离刺激人淋巴细胞增值率: 注:横坐标为刺激培养天数 由对比图可以看出,IPHASE CD3/CD28 beads 刺激培养T淋巴细胞扩增与国内某其他厂家产品相比,T淋巴细胞增值率明显高于其他厂家产品。 T细胞刺激增值其他IPHASE相关产品 关    于    我    们 汇智和源,致力于为创新药研发企业及生命科学研究机构提供高品质的生物试剂,IPHASE为公司核心品牌,品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。 购    买    方    式 电话:400-127-6686 微信:直接扫描右侧微信二维码添加购买
原代肝细胞三维培养模型在药物代谢和毒性评估中的应用 2022-07-29
原代肝细胞二维(2D)培养具有操作简单、费用低等优点,是目前体外药物代谢和毒性评估广泛使用的细胞模型。由于2D培养不能模拟体内微环境和细胞生长状态,2D细胞模型在组织结构、基因表达以及生物学特性等方面与体内细胞相去甚远。三维(3D)细胞培养可提供与体内相似的支架系统,创建与体内类似的生长环境,具有与来源组织十分接近的结构特征和功能特性。肝细胞3D培养模型必将在未来药物代谢、毒性评估以及疾病细胞模型中逐步取代2D肝细胞模型。 1    3D培养简介 1.1  3D细胞培养定义 3D细胞培养是指将具有三维结构的材料与细胞在体外共同培养,使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长,构成三维的细胞载体复合物。3D培养类似于细胞在体内的生长方式,既能保留体内细胞微环境的物质及结构基础,又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。 1.2  3D细胞培养优势 体外模拟复杂的组织结构,接近体内细胞生长环境,实现真实的细胞生 物学功能。 准确建立靶组织模型,有效预测病程和药物反应。 少量细胞可实现快速生长,兼容自动化仪器,降低成本。 1.3  3D细胞培养方式 无支架培养:悬滴培养,磁悬浮培养,超低粘附培养面培养等。 支架培养:天然支架,合成支架。 2    原代肝细胞3D培养模型 2.1 肝细胞球聚体培养模型 肝细胞球聚体培养是通过无支架3D培养方式,接种培养的肝细胞可形成直径达100-200µm球状聚集体。肝细胞球聚体与机体肝组织在结构和功能上十分相似,都是由胶原、弹性蛋白、蛋白多糖和糖蛋白所构建的立体网络结构支持和调节,球聚体内部可出现类胆管结构,用核磁共振光谱扫描肝细胞球聚体,球聚体代谢产物谱与体内肝脏最相似,而与2D培养的肝细胞差异很大。此外,肝细胞存活时间和肝特异性功能(如细胞色素P450活性和白蛋白合成等)维持时间都比2D培养的肝细胞显著延长。 最近一项研究表明人原代肝细胞经球聚体培养后存活时间超过5周,且CYP酶活性几乎没有变化。肝细胞球聚体在蛋白质组水平上与在体肝脏非常相似,负责药物吸收、分布、代谢和排泄的酶能持续表达14天以上。2D培养的肝细胞最多存活7-10天左右,而肝细胞球聚体超长的存活时间非常适用于药物的肝毒性评估。最近报道了一种由肝细胞和非实质细胞组成的球聚体反复暴露于化学物质28天后,显示其对肝毒性的敏感性增加,这些结果表明重复暴露对检测肝毒性的重要性。 2.2 肝细胞三明治培养模型 在体外通过在两层胶原或Matrigel内培养肝细胞可以重构体内结构,称为三明治培养。三明治培养的肝细胞能广泛形成胆汁毛细管网状结构,而且可以长时间保持肝脏特异性功能,同时具转运胆汁酸和维持钠离子-牛胆酸共同转运多肽的功能。三明治培养的肝细胞代谢酶活力可维持2周左右,且无代谢退化现象。在2D培养的大鼠肝细胞中,细胞色素CYP3A仅在d1表达,而在三明治培养的肝细胞中却可表达2周左右,且表达量随着培养时间的延长而显著增加。肝细胞三明治培养的另一个主要特点是能激活需经过代谢才具遗传毒性的化合物,且该活性能维持2周左右,而2D培养的肝细胞在最初接种培养几个小时后丧失这种能力。虽然无细胞体系(如肝S9)能代谢化合物成遗传毒形式,但在代谢过程中扰乱了化合物的激活/去毒平衡,因此与完整细胞体系的代谢产物谱差异很大。三明治培养的肝细胞比肝S9表现出更真实的遗传毒效应。 3    IPHASE原代肝细胞产品 IPHASE/汇智和源凭借多年的技术能力和技术经验的积累,现已形成猴、犬、大鼠、小鼠等原代肝细胞产品,并且在已有原代肝细胞产品的基础上,聚焦研发肝细胞球聚体和三明治培养肝细胞等3D细胞模型,为广大客户提供更为合适的体外药物评价细胞模型。 4    IPHASE原代肝细胞优势 l  安全性 IPHASE/汇智和源分离原代肝细胞所用动物均经过传染源检测,使用安全、更放心。 l  纯度高 IPHASE/汇智和源生产的原代肝细胞经分离纯化后纯度高,状态好。 l  活性好 IPHASE/汇智和源生产的原代肝细胞,复苏存活率可达90%以上,所有种属原代肝细胞均经过体外代谢质控,代谢活性强。 5    相关产品 关    于    我    们 汇智和源,致力于为创新药研发企业及生命科学研究机构提供高品质的生物试剂,IPHASE为公司核心品牌,品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。 购    买    方    式 电话:400-127-6686 微信:直接扫描右侧微信二维码添加购买
微量波动Ames试验试剂盒——药物早期毒性筛选的最佳选择 2022-07-25
1    微量波动Ames试验 在药物发现与早期筛选阶段,微量波动Ames试验(Ames Fluctuation Test)可以在化合物用量较少的情况下,有效筛选排除具有遗传毒性的化合物。汇智和源针对微量波动Ames试验,开发出一套包含整个实验主要试剂的试剂盒——微量波动Ames试验试剂盒,试剂盒以微型96孔板形式进行细菌突变测试,适用于早期药物遗传毒性评估,可在测试化合物有限的情况下进行预筛选。 2    IPHAES微量波动Ames试剂盒的优势 自己配试剂:菌株稳定性差!试剂多!计数烦!费时间!易污染!等货期! 微量波动Ames试验(Mini-Ames)试剂盒:全套试剂!活化菌株!定量配置!稳定准确!拿来即用! IPHAES微量波动Ames试剂盒: 一次试验 不用两周 不用一周 三天搞定 3    IPHAES微量波动Ames试剂盒组分 ① 菌株 TA98,TA100 ② S9 ③ 阳性药等 l  产品优势 ① 便捷性:省去诱导S9制备、菌株培养和鉴定、试剂配制时间,可以直接使用,大大缩短了实验周期。 ② 准确性:试剂盒各成分均经过严格的质量检测,实验结果准确、可靠、重现性高。 ③ 高效性:利用显色原理判断受试物的致突变性,大大减少计数工作。 ④ 稳定性:试剂盒稳定性强、易于运输和保存。 ⑤ 应用广:可用于食品、药品、化妆品、化学品、保健品、农药等的遗传毒性研究 l  适用范围 ① 药物遗传毒性早期筛选 ② 化学品,农药,兽药等遗传毒性早期筛选 ③ 化合物开发的早期阶段或在测试材料供应有限或用于培训目的时进行预筛选 4    相关产品 参    考    资    料: [1]OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No.471,Adopted:21,July 1997). [2]Green M.H.L.,Muriel W.J.,Bridges B.A.. Use of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens[J]. Green M.H.L.;Muriel W.J.;Bridges B.A.,1976,38(1). [3]Gatehouse D. Detection of mutagenic derivatives of cyclophosphamide and a variety of other mutagens in a "microtitre" fluctuation test, without microsomal activation.[J]. Mutation research,1978,53(3). 关    于    我    们 汇智和源,致力于为创新药研发企业及生命科学研究机构提供高品质的生物试剂,IPHASE为公司核心品牌,品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。 购    买    方    式 电话:400-127-6686 微信:直接扫描右侧微信二维码添加购买
微量波动Ames试验在遗传毒理研究中的应用 2022-07-15
1    微量波动Ames试验简介 1.1 Ames试验发展历程 细菌回复突变试验(Bacterial Reverse Mutation Test) ,亦称Ames试验,于1975年由美国加利福尼亚大学伯克利分校生化系B.N.Ames教授实验室建立并不断发展完善,至今已成为世界范围内基因毒性测试中应用最为广泛的一种方法,通常是体外毒理学测试的第一步,广泛应用于化合物的致突变性和潜在致癌性的初筛检验。近几年,将M.H.L. Green等人创建的大肠杆菌回复突变试验引入其中,形成现在较为成熟的细菌回复突变试验(包括鼠伤寒沙门氏菌细菌回复突变试验和大肠杆菌细菌回复突变试验)。 1976年Green等通过改良建立了Ames波动试验(Ames Fluctuation Test),它用液体培养基代替固体培养基,以观察培养管的浊度或pH指示剂的颜色变化代替菌落计数,其敏感性高于Ames试验。 微量波动Ames试验试验(Micro-titre Fluctuation Ames Test)试验是在Ames波动试验的基础上发展而来的,由Gatehouse于1978年改良并不断推广,用96孔培养板进行试验,以观察pH指示剂的颜色变化指示结果,提高了灵敏度、并降低了化合物的用量。 后来,Gee等通过开发新菌株,建立了AmesⅡ试验,Gee等开发的6种沙门氏菌株(TA7001~TA7006)在组氨酸合成操纵子上各有一个独特的点突变,这6种点突变包含了所有点突变的可能性,将6种菌株混合在一起(Tamix),即能够检测出所有可以诱发点突变的化合物,再配合一种传统Ames试验中采用的菌株TA98(用于检测移码突变),就可以检测出可以诱发点突变和移码突变的化合物。 1.2 传统Ames试验与微量波动Ames试验比较 传统 Ames 试验是对致癌物预测性最好的遗传毒性试验,是药物遗传毒性初筛的首选方法,也是QSAR构效关系建立的遗传毒性数据库的重要数据基础。传统的Ames平板渗入法采用半固体培养液,在有外源致突变物存在的情况下,组氨酸/色氨酸缺陷型菌株发生回复突变,回复为野生型,可在无组/色氨酸的培养基上生长,故可根据菌落形成数量,检查受试物是否为致突变物。然而,开展传统的Ames试验需4~5种菌株,试验过程涉及到培养大量的琼脂平板以及繁复的平板菌落计数等,耗费实验材料多,费时费力,且受试化合物用量大,敏感性低的缺点。 相比传统的Ames试验方法,微量波动Ames试验采用了液态96孔板培养的方法,在微孔板中进行受试物和菌株的孵育,利用培养基中的特殊指示剂溴甲酚紫显色。当孔中有回复突变的菌株生长使培养基pH值降低时,指示剂由紫色变为黄色。外源化合物致突变能力越强,变色的孔数越多。通常,微量波动Ames试验选用TA98和TA100两种菌株作为测试菌株,试验结果可通过计数变色的孔数或用酶标仪直接读数,省去了平板菌落计数的繁琐和耗时的过程,且因其试验的全液体环境,使得试验灵敏度更高。 1.3 微量波动Ames试验的优势 l  高通量 微量波动Ames试验过计数黄色孔的数量来反映受试物的致突变性,从而省去了平板制作和菌落计数等步骤,可实现高通量、自动化,具有节省耗材、节约药量、缩短试验周期、结果客观、适宜大量药物筛选的优点。 l  高灵敏度 波动试验比平板试验灵敏,其主要原因可能是:①在波动试验中细菌可在低浓度的诱变剂中处理较长时间;在平板试验中受测化学物将扩散至底层琼脂而被稀释,因此产生同样效应需更高的起始浓度,而有些化学物浓度增高后又会导致毒性效应。②液体培养有利于S9组份酶活性的正常发挥,在平板试验中可溶性酶扩散入底层琼脂会扰乱酶的代谢活力。 l  化合物用量少 Ames波动试验是用96孔板进行试验,化合物用量少,可作为新药开发的早期,受试物样品种类多、产量少或受试物较珍贵时评价遗传毒性的快速方法。 2    IPHASE微量波动Ames试剂盒 IPHASE/汇智和源顺应遗传毒理研究的需求,通过多年的开发和优化,推出了微量波动Ames试剂盒,为遗传毒理学研究提供了便捷的产品。 图1 IPHASE微量波动Ames试验试剂盒试验结果 2.1 微量波动Ames试剂盒组成  IPHASE/汇智和源微量波动Ames试剂盒由A盒和B盒两个包装组成,包含了进行试验所需的所有试剂和主要耗材,使用简单、便捷。 2.2   微量波动Ames试剂盒优势 l  便捷性  省去诱导S9制备、菌株培养和鉴定、试剂配制时间,可以直接使用,大大缩短了实验周期。 l  准确性  试剂盒各成分均经过严格的质量检测,实验结果准确、可靠、重现性高。 l  高效性  利用显色原理判断受试物的致突变性,大大减少计数工作。 l  稳定性  本试剂盒稳定性强、易于运输和保存。 l  应用广  应用范围广,可用于食品、药品、化妆品、化学品、保健品、农药等的遗传毒性研究 3    相关产品 IPHASE/汇智和源凭借多年的研发经验,推出了多领域、多种类的高端科研试剂,为药物早期研发提供筛选工具,为生命科学领域的探索提供新材料、新方法和新手段,为食品、药品、化学品等的遗传毒性研究提供便捷产品 关    于    我    们 汇智和源,致力于为创新药研发企业及生命科学研究机构提供高品质的生物试剂,IPHASE为公司核心品牌,品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。 购    买    方    式 电话:400-127-6686 微信:直接扫描右侧微信二维码添加购买
原代肝细胞的分离、培养与应用 2022-07-11
肝脏是药物代谢的重要器官,体外代谢模型多以肝脏为基础。常用的体外模型有肝微粒体、肝S9、肝胞质液、原代肝细胞、肝组织切片、重组人代谢酶等。其中,原代肝细胞因具有较好的体外试验重现性,基本维持了肝脏的代谢功能,特别是较好的保留了与体内一致的酶水平,成为了体外药物试验的“金标准”,广泛应用于药物代谢与毒理学研究中。 1     原代肝细胞及其应用 原代肝细胞(Primary hepatocytes)是指从动物肝脏取出后立即培养的肝细胞。原代肝细胞作为一种体外模型,具有其它体外模型不可替代的优点: ①与体内环境保持一致,酶量和辅助因子水平都是正常的生理浓度,可以在接近生理状态的的情况下研究药物的代谢和毒性; ②较好保留和维持了肝细胞的完整形态和肝细胞体外代谢活性,真实反应了体内的代谢情况。 随着技术水平的不断提高,原代培养的动物和人肝细胞已广泛应用于药物研究: ①探讨药物在肝中的代谢途径和药物药代动力学的研究; ②评价药物和外源性物质对肝脏中细胞色素P450酶诱导作用并探讨其诱导机制; ③预测和解释药物与药物之间的相互作用; ④研究药物的细胞毒性等。 2     原代肝细胞分离 肝细胞是高度分化的细胞,具有丰富的酶系及多种特异性功能,被广泛用于生物化学、实验性肝损伤、药代动力学、 毒理学和致癌作用等研究。然而,分离并培养出高活性的原代肝细胞成为了关键步骤,分离的原代肝细胞在体外是否能够存活 目前,原代肝细胞分离常用的方法有直接剪切法、组织块消化法和两步胶原酶灌流法等。其中,两步胶原酶灌流法因其对肝细胞损伤作用较小,在胶原酶消化细胞前使用了螯合剂,提高了肝细胞的产量和活力,分离的肝细胞数量多且活力好,成为了分离原代肝细胞的经典方法。 两步胶原酶灌注法先使用无钙灌流液灌注,无钙灌流液作为预灌液,可以将肝脏内的残留血液灌注出,除去或者减少细胞间的钙离子,以减少细胞间的粘着力。经无钙灌流液灌注后再使用含酶灌流液进行灌注把组织中的细胞释放出来。胶原酶在消化肝的同时解除了细胞间接触抑制或活化了潜在的蛋白激酶、生长因子或受体,使肝细胞能逐渐适应消化分离过程中所发生的细胞、外环境及细胞的各种改变,这些改变对离体肝细胞修复、生长及功能有重要的促进作用,有利于肝细胞的培养。 3    IPHASE原代肝细胞产品 IPHASE/汇智和源凭借多年的技术能力和技术经验的积累,不断摸索和优化原代肝细胞分离过程,现已形成猴、犬、大鼠、小鼠等原代肝细胞产品。 4    IPHASE原代肝细胞优势 l  安全性 IPHASE/汇智和源分离原代肝细胞所用动物均经过传染源检测,使用安全、更放心。 l  纯度高 IPHASE/汇智和源生产的原代肝细胞经分离纯化后纯度高,状态好。 l  活性好 IPHASE/汇智和源生产的原代肝细胞,复苏存活率可达90%以上,所有种属原代肝细胞均经过体外代谢质控,代谢活性强。 5    相关产品 关    于    我    们 汇智和源,致力于为创新药研发企业及生命科学研究机构提供高品质的生物试剂,IPHASE为公司核心品牌,品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。 购    买    方    式: 电话:400-127-6686 微信:直接扫描右侧微信二维码添加购买
细胞分选方法概述 2022-07-07
1    细胞分选方法概述 细胞学研究中一个很重要的课题就是细胞的分离纯化,尤其是需要对某种特定的细胞进行功能研究,如对细胞培养上清液通过ELISA分析检测细胞因子、细胞共培养检测细胞功能等,都需要得到高纯度的目的细胞。因此,高效地分离所需要的目的细胞是进行细胞功能研究的先决条件。 细胞分选(cell sorting)是指根据细胞所具有的特性把某种特定的细胞亚群从混合的细胞样品中分离出来的一种技术,它是对某一特定细胞进行生化分析和功能分析的前提和基础。常用的细胞分选方法主要有两大类:一类是基于细胞物理性质的密度梯度离心法(Density gradient centrifugation),另一类是基于免疫识别特性的方法,包括荧光激活细胞分选方法(Fluorescence-activated cell sorting,FACS)和磁性激活细胞分选法(Magnetic-activated cell separation,MACS)。 密度梯度离心法是基于不同的细胞群之间存在沉降系数差异的原理建立起来的,在一定的离心力的作用下,不同种类的细胞会以各自不同的速度沉降,在密度梯度不同的区域上会形成区带。这种方法简单易行,但此种方法分离所得到的细胞纯度较低,且细胞表面的标志不明确,特异性较差,目前使用较少。 流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是20世纪60年代后期发展起来的一种利用流式细胞仪(Flow cytometer)进行快速定量分析细胞亚群的物理化学特性,根据这些物理化学特性精确分选细胞的新技术,FCM主要包括流式分析和流式分选两部分。FACS最初于1972年提出,是指荧光驱动的细胞分选新技术,即利用分选型流式细胞仪分选标记有荧光素偶联抗体的细胞样品,通过荧光系统区分目的细胞和非目的细胞。流式细胞仪通过接受激光照射后液流内细胞的散射光信号和荧光信号反映细胞的物理化学特性,如细胞的大小、颗粒度以及抗原分子的表达情况等,目前已被广泛应用于生命科学及其相关领域的基础研究。流式细胞分选被认为是细胞分选的“金标准”,它分选所得的细胞纯度高、回收率高、且操作环境为全封闭型,不易被污染。但是,该方法所需设备比较昂贵,耗时,且需要高水平的技术支持以及专业的操作人员;且该方法在一段时间内只能分选一个细胞样品,若试验需要从不同的样品中分选目的细胞时这种方法不可行;同时,由于FACS对细胞刺激较大,因此对分选出的细胞活性有较大影响。 磁性细胞分选(MACS)是20世纪70年代发展起来的,是用结合有抗体的免疫磁珠与样品细胞进行孵育,表达有相应抗原的细胞就会特异性的结合在包被有抗体的免疫磁性微粒上,当体系缓慢的经过磁场时,带有磁珠的细胞就会滞留在磁铁上,而非目的细胞由于未结合磁珠仍存在与混合细胞悬液中,从而达到分离纯化细胞的目的。MACS法是一种相对高效简便的细胞分选方法,所需设备简单,只需一块专用磁铁即可进行分选,操作较为简单,对操作人员的技术要求也不高,一般实验室都可进行磁性分选。磁性分选只是让细胞处于一个低磁场中,基本可以忽略对细胞的影响,分离得到的细胞具有较高的复苏率及细胞活性,对于下游应用影响较小,在保持细胞活性方面优于流式分选。磁性分选因其高灵敏度、高纯度、易操作、对目的细胞刺激较小等特性成为了细胞分选的方法,具有潜在的应用前景。 2    相关产品 IPHASE/汇智和源凭借多年的研发经验,推出了多领域、多种类的高端科研试剂,为药物早期研发提供筛选工具,为生命科学领域的探索提供新材料、新方法和新手段,为食品、药品、化学品等的遗传毒性研究提供便捷产品。 关    于    我    们 汇智和源,致力于为创新药研发企业及生命科学研究机构提供高品质的生物试剂,IPHASE为公司核心品牌,品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。 购    买    方    式: 电话:400-127-6686 微信:直接扫描右侧微信二维码添加购买
CYP450酶内源性生物标志物的研究进展 2022-07-03
      CYP450酶广泛参与药物的I相代谢过程,CYP450酶活性受到基因、性别、年龄、疾病等多种因素的影响,CYP450酶活性直接影响经 CYP450酶代谢药物的体内代谢过程。测定CYP450酶活性有助于了解药物在体内的代谢情况,预测药物疗效和不良反应。测定CYP450酶活性的方法主要有外源性探针药物法和内源性生物标志物法,前者广泛应用于临床,但需要服用探针药物,后者无需额外服用药物,安全性和依从性更高。本文综述了CYP1A2、CYP2A6、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A等6种重要CYP450酶亚型内源性生物标志物的研究进展。       药物的有效性和安全性与其在体内的吸收、分布、代谢和排泄有关,而细胞色素P450(Cytochrome P450,CYP450)酶参与80%~90%药物的Ⅰ相代谢。因此, 希望通过检测CYP450酶活性,了解药物的体内代谢过程,预测药物疗效和不良反应。CYP450酶的活性受到多种因素的影响,包括基因、性别、年龄、疾病等,不同个体间代谢酶的活性可能有较大差异,如CYP2C19不同突变体会造成个体间的药物代谢差异,因此需要密切关注代谢酶的活性。外源性探针广泛用于临床试验中CYP450酶活性的测定,这种方法需要受试者服用探针药物(如检测CYP3A活性需口服咪达唑仑),同时采集受试者血样以测定血药浓度。但以非治疗为目的且需要频繁地采血,在特殊人群(如小儿、孕妇、老人等)中应用存在着困难。CYP450酶参与机体内源性化合物的代谢,如胆固醇、脂肪酸等,部分内源性物质可作为测定CYP450酶活性的生物标志物。内源性内源性生物标志物用于评价CYP450酶活性不借助外源性探针药物,利用某些内源性物质及其代谢物的水平变化来反映酶的变化,具有更好的依从性。本文汇总了CYP1A2、CYP2A6、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A,6种重要CYP450酶亚型内源性生物标志物的研究进展。 1 对主要CYP450酶内源性生物标志物的分析 1.1 人体内的CYP450 药物代谢发生在肝脏、小肠、肾等组织中,肝脏是代谢的主要器官,其微粒体酶活性最强。其中最重要的氧化酶因其在还原状态下可与CO结合,在波长450nm处有一最大吸收峰,故认为是细胞色素P450酶。位于肝脏内质网和线粒体内膜上的CYP450是参与药物Ⅰ相代谢的关键酶,经酶催化的氧化反应是药物体内代谢的主要途径。CYP450参与了许多内源性物质如脂肪酸、花生四烯酸的代谢过程和外源性化合物如药物、环境中污染物的处置过程。CYP450酶是一个参与编码500多种酶蛋白的超家族。其可按氨基酸的序列分类,同一家族的氨基酸序列有40%相似性,同一亚家族相似性超过55%。在人肝微粒体中参与药物代谢的CYP450酶主要有CYP1A、CYP2C、CYP2D、CYP2E、CYP3A五大类,它们占肝脏中CYP450酶总含量>75%。 1.2 CYP1A2的内源性生物标志物 CYP1A2约占CYP450酶总量的13%,仅次于CYP3A和CYP2C。CYP1A2参与咖啡因、硝苯地平、华法林、普萘洛尔等多种外源性药物的代谢,也负责部分内源性激素的羟化反应,除此之外,CYP1A2也参与一些前致癌物(黄曲霉毒素、亚硝胺等)在体内的活化过程。测定CYP1A2活性的外源性探针药物主要是咖啡因,内源性生物标志物主要有褪黑素(melatonin)及其6-羟基化代谢物(6-hydroxymelatonin)。在体外肝微粒体模型研究中发现,褪黑素通过CYP1A1、CYP1A2及CYP1B1代谢生成6-羟基褪黑激素,其中CYP1A2为肝内主要代谢酶。Wang和Hiemke通过高效液相色谱结合电化学检测法,发现褪黑素主要代谢为6-羟基化代谢物和N-乙酰羟色胺(N-acetylserotonin,NAS),添加CYP1A2的特异性抑制剂呋拉茶碱后,仅检测到少量NAS,推测6-羟基代谢物是经CYP1A2代谢,理论上褪黑素及其6-羟基化代谢物可作为检测CYP1A2活性的内源性生物标志物。 目前检测人体中褪黑素的方法有高效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS/MS)和酶免疫检测法(ELISA)。有研究利用生物免疫法测定血清褪黑素的药时曲线下面积(AUC),分别测定受试者吸烟(增加CYP1A2的活性)前后外源性和内源性血浆褪黑素水平变化,结果外源性血浆褪黑素水平在吸烟后显著降低,而内源性血浆褪黑素水平未受到显著影响。现有研究将外源性褪黑素作为CYP1A2探针,但因其缺乏相关理论,还存在争议。研究表明,咖啡因的清除率与内源性血清褪黑素AUC值不存在显著的相关性,而在人体内咖啡因清除率的90%以上由CYP1A2介导,产生这些结果的原因可能是内源性褪黑素的含量不仅与CYP1A2代谢有关,还与褪黑素的重新分泌有关,褪黑素的分泌作用掩盖了它的含量变化。因此,使用内源性褪黑素作为CYP1A2的探针,应选择合适的指标,如排除褪黑素分泌昼夜节律的影响。 1.3 CYP2A6酶的内源性生物标志物 CYP2A6广泛参与药物的代谢,如依非韦伦、来曲唑等,同时也能将许多致癌前体化合物代谢为强致癌物,如将烟草中大量的亚硝胺致癌前体化合物代谢为亚硝基亚甲胺。CYP2A6的外源性探针主要是香豆素。吸烟者体内含有尼古丁,尼古丁经CYP2A6的代谢产物可替宁(cotinine,COT)和反式-3'-羟基可替宁(trans-3'-hydroxycotinine,3HC)可作为表征CYP2A6酶活性的内源性标志物。以内源性生物标志物评价酶活性的方法有COT/尼古丁和3HC/COT的比值(C3HC/CCOT)。由于尼古丁的半衰期(2h)比COT的半衰期(16h)低得多,若考虑使用COT/尼古丁的比值评价CYP2A6的活性,CYP2A6活性结果取决于最后一次接触尼古丁的时间,需要提前较长时间禁止受试者接触尼古丁,使体内COT被完全代谢;若使用C3HC/CCOT评价CYP2A6的活性,3HC由COT产生,半衰期较短(6h),C3HC/CCOT与COT的半衰期相关,与COT/尼古丁的比值相比,以C3HC/CCOT作为内源性生物标志物评价更加稳定。Dempsey D等研究表明,唾液和血浆中C3HC/CCOT与尼古丁口服清除率有显著的相关性,而尼古丁代谢的主要指标是尼古丁的口服清除率,表明C3HC/CCOT与尼古丁的代谢有高度相关性,进而证实C3HC/CCOT是表征吸烟者CYP2A6活性的可靠内源性生物标志物。测定3HC和COT浓度的主要方法为GC-MS和HPLC-MS/MS。 以C3HC/CCOT评价CYP2A6活性的方法在临床上已有了应用,如LermanC等通过测定C3HC/CCOT预测了尼古丁经皮治疗戒烟的有效性,在C3HC/CCOT低的患者中有46%的人戒烟成功,而在比值高的患者中仅有28%的人戒烟成功,C3HC/CCOT与戒烟效果有显著的相关性,CYP2A6快代谢患者比慢代谢患者的戒烟效果较差,表明C3HC/CCOT对预测尼古丁经皮治疗的戒烟成功率有着重要临床意义。 1.4 CYP2C19酶的内源性生物标志物 经CYP2C19代谢的药物占CYP450酶代谢的2%,临床上参与代谢有许多重要药物,如奥美拉唑、氯匹格雷等。CYP2C19的外源性探针主要有奥美拉唑、美芬妥英,内源性生物标志物还在研究中,研究方向主要是花生四烯酸(AA)。 花生四烯酸可被所有CYP450酶代谢,但经CYP2C19代谢的代谢率最高 , 生成4种环氧三烯酸 (epoxyeicosatrienoic acids,EETs)和11种羟基花生四烯酸(hydroxyeicosatetraenoic acids,HETEs)。研究认为,EETs可代谢生成碳三烯酸(dihydroxyeicosatrienoic acids,DHETs),其中11,12-DHET和14,15-DHET是EET占比最大的代谢产物。为证明CYP2C19活性与EET水平呈正相关,AkasakaT等测定了不同CYP2C19活性的血清样本中11,12-和14,15-DHETs的浓度,用来替代EET水平,发现CYP2C19慢代谢受试者的血清11,12-和14,15-DHETs水平显著低于快代谢受试者,检测DHET的方法主要有酶联免疫法。 但DHET并非EETs经CYP2C19代谢的直接产物,是EET经可溶性环氧化物水解酶生成的代谢产物,其浓度受到该水解酶影响,故无法利用血清11,12-和14,15-DHETs水平代替EET水平评价CYP2C19的活性。未来需要直接研究AA的代谢产物EETs、HETE的水平与CYP2C19活性的关系,以验证AA是评价CYP2C19活性的内源性生物标志物。 1.5 CYP2D6酶的内源性生物标志物 CYP2D6存在于肝脏、心脏和脑组织中,参与约25%药物的代谢,如阿片类药、抗精神病药、抗抑郁药等。CYP2D6的外源性探针有右美沙芬,内源性生物标志物有5-甲氧基色胺(5-methoxytryptamine,5-MT)/5-羟色胺(serotonin,5-HT)和松香烃(pinoline,PIN)/6-羟基-1,2,3,4-四氢化-β-咔啉(6 -hydroxy -1,2,3,4-tetrahydro-beta-carboline,6-OH-THBC)。 5-MT是一种微量的内源性吲哚胺类,YuAM等发现5-HT是唯一经CYP2D6介导的5-MT的代谢物。之后Kirchheiner J等测定了经不同活性CYP2D6代谢后血小板中5-HT的浓度,结果显示,CYP2D6活性高的受试者体内5-HT的含量显著高于CYP2D6活性低的受试者,提示5-MT/5-HT可能是测定CYP2D6活性的内源性生物标志物。但5-HT的半衰期较长(大于3天),可能会因代谢不及时而不能准确反映CYP2D6的活性,研究发现,受试者服用CYP2D6抑制剂24h后体内5-HT含量无明显变化。因此,需要进一步的临床研究来验证5-MT/5-HT能否作为内源性生物标志物、以反映CYP2D6的活性。 PIN是一种存在于哺乳动物大脑和组织中的内源性化合物,经CYP2D6特异性地发生O-去甲基化代谢为6-OH-THBC。Jiang XL等发现,在人肝微粒体中,加入8种代谢酶抑制剂后,只有奎尼丁(CYP2D6抑制剂)对PIN的O-去甲基化反应有明显的抑制作用,并在注射PIN后,野生型小鼠体内的PIN/6-OH-THBC值(0.29±0.19,n=4)显著高于CYP2D6转基因小鼠(0.0070±0.0048,n=4)。基于此研究,PIN/6-OH-THBC被认为可能是反映CYP2D6活性的内源性生物标志物。 目前,通过测定尿液中的C6-OH-THBC/CPIN比值评价人体内CYP2D6的活性。如米氮平为经CYP2D6代谢的抗抑郁药物,高达40%的患者存在耐药现象,Sychev DA等利用口服米氮平患者尿液中C6-OH-THBC/CPIN比值反映CYP2D6活性,CYP2D6活性高的患者米氮平代谢加快,药效降低,提示可以根据C6-OH-THBC/CPIN比值来指导临床用药,减小耐药性的发生。但以上研究未将C6-OH-THBC/CPIN比值与特异性探针药物的代谢结果进行比较,因此以C6-OH-THBC/CPIN比值作为内源性指标还需要进一步研究确认。 1.6 CYP2E1酶的内源性生物标志物 CYP2E1参与约90种外源性药物以及各种内源性脂肪酸的代谢,包括月桂酸、硬脂酸、花生四烯酸等,也能代谢体内多种有毒底物,如乙醇、四氯化碳等。测定CYP2E1活性的典型外源性探针药物为氯唑沙宗、月桂酸(lauric acid,LA)及其(ω-1)-羟基化产物11-羟基月桂酸(11-hydroxylauric acid,11-OH-LA),均是测定CYP2E1活性的内源性生物标志物。 Amet Y等发现,经CYP2E1诱导剂(吡啶、丙酮、异烟肼等)处理的鼠肝微粒体产生更多的11-OH-LA。Choi YJ等考察了人肝微粒体中14种CYP重组酶对LA代谢反应的影响,发现经CYP2E1代谢的11-OH-LA生成率最高。同时,氯唑沙宗发生6-羟基化反应生成6-羟基化氯唑沙宗,而LA的(ω-1)-羟基化反应和氯唑沙宗的6-羟基化反应具有显著的相关性。综上,LA/11-OH-LA可能是测定人或鼠肝微粒体中CYP2E1活性的内源性生物标志物。目前研究建立HPLC法和HPLC-MS/MS法测定了人肝微粒体中LA和11-OHLA浓度,并研究了LA/11-OH-LA与CYP2E1活性的关系。然而,仅在人肝微粒体进行了部分研究,仍需进一步的临床研究验证LA/11-OH-LA能否用于测定人体CYP2E1的活性。 1.7 CYP3A酶的内源性生物标志物 CYP3A是肝脏中最重要的代谢酶之一,在肝脏和小肠中表达最为丰富,约占肝脏总CYP含量的30%,参与约50%上市药物的代谢。CYP3A常用的外源性探针药物主要是咪达唑仑,且对测定CYP3A活性的内源性生物标志物也研究众多,其中常用的两种内源性标志物有:氢化可的松(cortisol)及其代谢物6β-氢化可的松(6β-hydroxycortisol,6β-OHF)和胆固醇(cholesterol)及其代谢物 4β-羟基胆固醇(4βhydroxycholesterol,4β-OHC)。 Shibasaki H等发现,患者服用利福平(CYP3A诱导剂)后,人肝微粒体中氢化可的松发生6-羟基化的活性更高。而用酮康唑(CYP3A抑制剂)处理人肝微粒体后,氢化可的松浓度显著升高。Furuta T等比较了CYP3A、CYP2B6和CYP2C9几种CYP450亚型对氢化可的松反应的影响,结果证实,氢化可的松主要经CYP3A发生6β-羟基化反应。基于以上研究,认为6β-羟基皮质醇是测定CYP3A活性的内源性生物标志物。6β-羟基皮质醇/皮质醇比值与皮质醇清除率可用于评价CYP3A的活性。目前,CYP3A活性评价的标准是咪达唑仑的清除率,研究表明,皮质醇清除率与咪达唑仑肾清除率有显著的相关性,但有文献发现,尿液6β-羟基皮质醇/皮质醇比值与咪达唑仑清除率无显著相关性。因此,认为皮质醇清除率比6β-羟基皮质醇/皮质醇比值评价CYP3A的活性更加准确。测定血浆和尿液中6β-羟基皮质醇和皮质醇浓度的分析方法包括ELISA、HPLC法和HPLCMS/MS法。 4β-羟基胆固醇是胆固醇经CYP3A代谢的内源性化合物,不受肾排泄功能和体内胆固醇水平的影响。血浆4β-羟基胆固醇浓度以及4β-羟基胆固醇/胆固醇与咪达唑仑血浆清除率有一定的相关性。然而,4β-羟基胆固醇的半衰期约为17天,要准确地检测4β-羟基胆固醇的浓度,至少需要等到2周以后,使浓度达稳态。测定血浆中4β-羟基胆固醇和胆固醇浓度的分析方法有GC-MS/MS法和HPLC-MS/MS法。 2 讨论 2.1 内源性生物标志物研究进展 CYP450各亚型内源性生物标志物见表1。综上所述,CYP1A2、CYP2A6、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A主要的内源性标志物分别为褪黑素/6-羟基褪黑素、3HC/COT、AA/EET和AA/19-HETE、5-MT/5-HT和PIN/6-HO-THBC、LA/11-OH-LA、6β-羟基皮质醇/皮质醇和 4β-羟基胆固醇/胆固醇。检测方法汇总见表2。 内源性生物标志物的相关进展主要体现在以下几个方面: (1)在某些研究选取的评价代谢酶活性的方法中,待评价的代谢酶不是该评价指标的主要影响因素,无法有效地评价酶活性,如CYP2C19酶活性的评价指标11,12-和14,15-DHETs水平不仅与CYP2C19酶活性有关,同时与环氧化物水解酶有关,未来需要选取更合适的评价方法进行研究,证明内源性生物标志物的可靠性。 (2)有些代谢酶的内源性生物标志物经过一定的临床研究后存在一些问题,如某些代谢产物(如5-HT和4β-羟基胆固醇)半衰期过长,难以评价酶的快速变化,某些评价酶活性的方法与外源性探针代谢结果无显著相关性(如R6β-羟基皮质醇/皮质醇),提示需选择更可靠的内源性生物标志物或评价方法。 (3)某些内源性生物标志物已通过临床研究证明其评价代谢酶活性的可行性(如3HC/COT和皮质醇清除率),但这些内源性生物标志物如何更好地用于临床评价还需要深入研究。 2.2 酶活性评价及临床应用 评价酶活性的方法主要有内源性代谢底物浓度、内源性代谢产物浓度,以及内源性代谢产物/代谢底物的比值。应用较为广泛的是内源性代谢产物的浓度和内源性代谢产物/代谢底物的比值,而内源性代谢底物的浓度较少用于酶活性的评价,可能是由于内源性底物的浓度受到多种因素的影响,包括代谢酶代谢和底物的重新分泌等,导致结果不可靠。 在临床研究中需要注意: (1)应选择半衰期合适的内源性生物标志物浓度。若半衰期过长,需要待体内底物代谢完全后再采集生物样本,对受试者要求较高,若半衰期过短,代谢产物可能在采集之前已被代谢, 需要严格控制采样时间。 (2)应选择合适的生物样本。目前用于临床研究的有唾液、血浆和尿液,各个样本有其各自优缺点。体内大多数物质经尿液排泄,浓度较高,容易采集,但可能存在代谢途径差异、个体间的肾脏清除率差异等问题,使结果不准确。血浆中内源性生物标志物的浓度更为稳定,但某些物质可能由于代谢较快而浓度过低,对检测要求更高,且采集过程需要抽血,受试者依从性较差。因此,可根据试验目的,选择快速、简便、准确的方法,测定各CYP450酶活性的生物样本。 (3)内源性探针的浓度存在个体间差异,建议临床研究时采集并测定基线值,以消除个体差异对CYP450酶活性评价的影响。 3 小结 内源性探针用于评价CYP450酶活性不借助外源性探针药物,利用某些内源性物质及其代谢物的水平变化来反映酶的变化,具有更好的依从性。本文汇总了这6种重要CYP450酶亚型内源性生物标志物的研究进展。目前,能用于准确评价CYP450酶活性的标志物还不多,个体差异、半衰期等问题还需要进一步的探讨。期待今后会有更多的临床研究,发现更为合适的内源性探针和评价方法。 关    于    我    们 汇智和源,致力于为创新药研发企业及生命科学研究机构提供高品质的生物试剂,IPHASE为公司核心品牌,品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。 购    买    方    式: 电话:400-127-6686 微信:直接扫描右侧微信二维码添加购买
脾脏单个核细胞分离方法及注意事项 2022-06-27
脾脏(spleen)位于上腹部左后侧,体积较大,长条形,是体内最大的淋巴器官,也是血流通路中的过滤器官。脾脏内定居着大量的淋巴细胞和其它免疫细胞,是机体发生特异性免疫应答的场所。 1    原理 单个核细胞的体积、形态和比重与其它细胞不同,在沉降过程中不同比重的细胞会处于不同的分布位置。因此,可利用各种血细胞和单个核细胞比重之间的差异将各种血细胞与单个核细胞分离开来。 2    方法 1)无菌条件下取出脾脏,在培养皿中加入适量的分离液,将脾脏放入细胞筛中,置于分离液中进行研磨(具体方法见示意图1)。 图1 脾脏研磨方法示意图 2)将悬有脾脏细胞的分离液立即转移入无菌离心管中,在上层覆盖适量的RPMI 1640培养基,且需保持液面分界清晰。 3) 800g,室温,离心 20min-30min(注:设置较慢的加速度和减速度,如果有十档,设为第三档)。 4) 离心结束后,吸弃RPMI 1640培养基,小心吸取脾脏单个核细胞层(即白膜层)并转移至15mL离心管中。离心结束后,管内液面从上至下依次为RPMI 1640培养基层、脾脏单个核细胞层、分离液层和红细胞层(见图2)。 图2 细胞悬液离心前后的分层状态图 5)向离心管中加入10mL 的RPMI 1640培养基洗涤细胞,250g,室温离心 10min ,弃上清。重复该步骤 1~2 次,即可用于后续试验。 3    注意事项 1)不同种属动物单个核细胞的比重有一定差异,请选择合适的分离液进行脾脏单个核细胞的分离。 2)分离液易挥发,在脾脏研磨过程中请尽量缩短时间,将研磨时间控制在5min以内。 3)研磨过程中请尽量控制研磨力度,保证细胞筛悬空,避免在培养皿底部直接研磨而造成细胞大量死亡。 4)若研磨后细胞悬液呈暗红色,需将其进行适量稀释后再进行后续操作。 5)为保证细胞的活力,整个操作过程请轻柔,避免对细胞造成机械性的损伤。 6)为保持细胞状态良好,请尽量缩短整个试验的周期。 4    脾脏单个核细胞分离试剂盒 IPHASE/汇智和源针对不同种属动物脾脏单个核细胞分离的特点,开发了对应的单个核细胞分离试剂盒,包括人,猴,犬,大鼠,小鼠,兔,猪等。该试剂盒包含单个核细胞分离液和洗涤液两个组分,各成分对细胞无毒性,不会影响细胞的原始状态;同时,该试剂盒操作简单便捷,可大大缩短细胞分离时间,分离所得细胞纯度高、状态好、得率高。 5    相关产品 关    于    我    们 汇智和源,致力于为创新药研发企业及生命科学研究机构提供高品质的生物试剂,IPHASE为公司核心品牌,品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。 购    买    方    式: 电话:400-127-6686 微信:直接扫描右侧微信二维码添加购买
酶抑制IC50试验研究原理和试验方法 2022-06-24
1    酶抑制研究的重要性 药物代谢的主要场所是肝脏,其中细胞色素 P450(CYP)酶为主要的代谢酶,其亚型 CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、 CYP3A4参与了体内80%以上的药物代谢。CYP酶是一个多功能的酶系,在体内具有可诱导性和可抑制性。该酶与药物的相互作用能够在所有的体内过程(包括吸收、分布、代谢和排泄)中发生,其中以代谢过程最为突出,约占40%。 近年发现,药物相互作用是临床上产生严重不良反应甚至死亡的主要原因之一。CYP参与的药物相互作用主要包括两种类型:酶抑制(enzyme inhibition)和酶诱导(enzyme induction)。酶抑制是指某些化合物能抑制肝脏药物代谢酶的活性,导致联合用药时一些药物代谢减慢,使得药物的血药浓度上升致毒性;酶诱导是指某些化合物能提高肝脏药物代谢酶的活性,导致合同的药物代谢速率加快,使得原药的血药浓度下降,使其疗效降低或丧失。 图1 药物相互作用模式示意图 为获得更好的治疗效果,联合用药在临床治疗中已非常普遍。然而,在获得更好的疗效的同时,常伴随着由药物-药物相互作用(drug-drug interaction,DDI)引起的不良反应事件的发生。如特非那丁与酮康唑合用时,酮康唑可显著地抑制特非那丁的代谢,造成特非那丁的血药浓度显著升高,可以导致致命的室间心律失常。 图2为采用肝微粒体技术研究西尼地平与几种临床常用药物间的代谢相互作用的实例,结果表明环孢素、红霉素和辛伐他丁在体外表现出对西尼地平代谢的抑制作用,由于三者均是CYP3A的抑制剂或底物,这提示西尼地平与CYP3A的抑制剂或底物合用时可能会出现代谢上的相互作用,使西尼地平的代谢速率降低,西尼地平二氢吡啶环脱氢代谢物生成减少,而原型药物的水平显著提高,这可能会影响临床疗效的正常发挥。 图2 人肝微粒体中几种临床常用药物对西尼地平代谢的影响 如果合用的药物具有潜在的抑制或诱导代谢酶的能力,则前者将受到合用药物的影响,从而使其代谢清除途径发生量化的改变,这种药物相互作用可能会影响治疗效果,增加药物的治疗失败率,甚至诱发不良反应。因此,通过对代谢酶表型的体外研究来判定该化合物的主要代谢酶亚型,已成为药物临床前代谢研究工作中必不可少的一部分。 2    酶抑制IC50研究试剂盒简介 参与药物代谢的CYP450酶主要为CYP1、CYP2和CYP3三个家族,共有7种重要的亚型,分别为CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4。通过考察不同浓度的药物对各种酶亚型的特异性底物的代谢速率的影响,得到半数抑制浓度(IC50),便可评价药物对酶的抑制作用。 公司针对酶抑制IC50研究的需要,以肝微粒体体外温孵法为指导,开发了一款专门用于酶抑制IC50研究的试剂盒,该产品可直接用于药物对CYP450活性抑制的的研究,省去了肝微粒体制备和试剂配制的繁琐过程,大大缩短了实验周期,且试剂盒各组成成分经过严格的质量检测,符合酶抑制IC50研究试验要求,实验结果准确、可靠、重现性好。 2.1 产品说明 本产品提供了药物酶抑制(IC50)研究的主要试剂,可直接用于药物对CYP450酶的半数抑制浓度(IC50)研究,省去了试剂配制的繁琐过程,且试剂盒各组成成分经过严格的质量检测,实验结果准确、可靠、重现性好。 根据微粒体种属的不同,可根据实际需求选择人肝微粒体、恒河猴肝微粒体、比格犬肝微粒体、大鼠肝微粒体和小鼠肝微粒体中的一种。 2.2 试剂盒优势 便捷——本试剂盒省去了肝微粒体制备和试剂配制时间,可以直接使用,大大缩短了实验周期。 准确——本试剂盒各成分均经过严格的质量检测,实验结果准确、可靠、重现性高。 稳定——本试剂盒稳定性强、易于运输和保存。 2.3 试剂盒组成 2.4 参考使用方法 2.4.1 试验组 1)冰浴融化试剂盒各组分,置于冰上待用; 2)除微粒体外,将孵育体系其它各组分按照配比混合并吹吸混匀,于37℃预孵育5min; 3)将以上混合液195μL/管分装至2.0mL离心管中,于37℃水浴中保温, 5μL/反应加入肝微粒体,吹吸3次混匀于37℃水浴条件下启动代谢反应,使用秒表计时; 4)于设定孵育时间点,向孵育体系中加入终止液终止反应(如预冷乙腈,预冷乙腈体积:孵育体系体积=1:1)。 例:200μL孵育体系配制: 注:a.体系中有机溶剂加入量不得大于1%; b.若实际需要n个孵育体系,则需配置n+1个体系; c.本实验需设置系列受试物浓度,通常为0μmol/L、0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L; d.参考使用方法仅为使用范例,需根据实际试验需求进行调整。 2.4.2对照组: 无A、B液组:反应体系中不加A液和B液,其它组分加入量不变,缺少体积用0.1M PBS缓冲液补齐。 2.4.3结果计算: 用各特异性探针底物的代谢物的生成速率反映微粒体孵育体系中各CYP450亚型酶的活性;设定只含代谢底物的孵育体系中各亚型酶活性为100%,作为对照;样品中代谢物生成速率相对于对照组生成速率的百分比,作为各亚型酶的剩余活性。 活性剩余百分比 = (某浓度样品底物代谢物生成速率/零浓度样品代谢物生成速率) × 100% 2.4.4使用注意事项: 1)试验开始前,请自行准备2.0mL离心管、不同规格枪头、37℃水浴锅等; 2)本产品仅供科研使用,不能用于人体及动物的治疗或临床诊断; 3)使用前,需于冰浴条件下解冻并混合均匀; 4)于-70℃冰箱冷冻保存,切勿反复冻融; 5)在使用过程中,也可根据实际实验需求调整试剂盒使用方法和各组分的加入量; 6)因CYP2B6和CYP2C19在体外没有绝对特异的抑制剂可用,故结果分析还需结合其它结果进行,如重组酶法的结果。 关    于    我    们 汇智和源,致力于为创新药研发企业及生命科学研究机构提供高品质的生物试剂,IPHASE为公司核心品牌,品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。 购    买    方    式: 电话:400-127-6686 微信:直接扫描右侧微信二维码添加购买
Ficoll密度梯度离心法提取PBMC原理及注意事项 2022-06-23
外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC),是指外周血中具有单个核的细胞,包括淋巴细胞(Lymphocyte)、单核细胞(Monocyte)、树突状细胞(DC)和其他少量细胞。PBMC可通过健康人或动物供体的外周血,通过Ficoll密度梯度离心法(IPHASE/汇智和源),磁珠分选等步骤获得。   Ficoll是蔗糖的多聚体,中性,平均分子量400,000,当密度为1.2g/mL,未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大,离心后沉于管底;淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重,离心后漂浮于分层液的液面上,也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞,就可从外周血中分离到单个核细胞。 人PBMC中不同细胞类型的比例 PBMC中大部分都是淋巴细胞,包括B细胞和T细胞,其中CD3 T细胞又占了淋巴细胞中绝大部分(45-70%)。这些T细胞都处于初始(naive)状态,即已经成熟了但没有受到抗原刺激。 在正常人中,只有非常小的一部分初始T细胞会因抗原识别而被激活。同样的B细胞也都处于初始状态。相对于淋巴细胞,单核细胞的比例在10-30%,收到刺激之后会发育成树突状细胞(DC)或巨噬细胞。干细胞的比例非常低,只有0.1-0.2%,因此很难从全血样本中分离到。 一、外周血单个核细胞(PBMC)制备方法 1.设备与试剂 全血 (以10ml为例) 无菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理盐水 蔗糖溶液(Ficoll Pague PLUS)  RPMI 1640培养基  胎牛血清(FBS) 双抗P/S (Penicillin/ Streptomycin)  二甲亚砜(DMSO) 预先装好异丙醇的冻存盒 2.方法/步骤 配制所需的溶液: a. 细胞培养基:RPMI 1640+10% FBS+1% P/S; b. 细胞冻存液:FBS中加入10%DMSO; (1)将10ml全血转入50ml离心管中,加入10ml PBS溶液稀释,轻轻混匀; (2)取两支15ml离心管,先加入5ml Ficoll溶液。然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层,一定要轻柔,避免两种溶液混合在一起,每只离心管各10ml稀释血液; (3)2,000rpm,20min,注意,降速设置中一定要设置成no break,或者只有1-2成的制动。离心完毕将得到如图所示分层; (4)PBMC所在细胞层为白色。此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml离心管中。 (5)加入PBS至10-15ml,1,500rpm,10min离心后去掉上清,再加入培养基进行相同操作的清洗; (6)加入5-10ml培养基重悬细胞,进行后续计数培养或者铺板; (7)细胞冻存:将细胞离心收集之后,用细胞冻存液重悬。取1-1.5ml细胞至冻存管中,放入冻存盒(冻存盒可事先在4℃冰箱预冷)。再将冻存盒放置于-80℃冰箱过夜。第二天将细胞转入液氮中长期保存。 IPHASE/汇智和源建议操作注意事项 (1)全血溶液可以加在Ficoll上层或者下层,但是最终都必须保证两种溶液分层清晰。 (2)分离PBMC第一步离心的时候,一定不能设置或设置低水平的制动。否则将分层混乱。 (3)人PBMC和动物PBMC分离方法稍有不同,动物PBMC需求可联系IPHASE/汇智和源。 细胞运输与保存 (1)干冰运输,收到细胞后立即转入液氮冻存或直接复苏; (2)T25瓶运输的新鲜细胞,收到后应继续生长,传代达到细胞生长状态良好时,再进行冻存,具体操作步骤见细胞培养步骤。 PBMC收到后注意事项 (1)收到PBMC细胞后首先观察细胞瓶是否完好,培养液是否有漏液、浑浊等现象,若有上述现象发生请及时反馈。 (2)先不打开瓶盖,瓶身擦拭酒精后放培养箱静置四小时,稳定细胞状态,切忌在温箱内静置过夜。 (3)静置后镜检,拍照,记录细胞状态。建议传代后也拍照记录细胞生长情况。 (4)贴壁细胞:若细胞密度超过80%,可正常传代;若未超过80%,收集细胞瓶内的培养基,留8ml继续培养至80%左右再传代,瓶盖可稍微拧松。 (5)细胞瓶内的培养基含血清和双抗,可收集后4℃保存备用,可补加2%血清。刚开始传代时建议一半用细胞瓶内的培养基,一半用自备的培养基,使细胞逐渐适应培养条件,以免因不适应而造成生长状态不佳。 (6)细胞胰酶消化液建议使用PBS配制。 IPHASE/汇智和源其他外周血单个核细胞: 人外周血单个核细胞 Human PBMC 猴外周血单个核细胞 Monkey PBMC 比格犬外周血单个核细胞 Dog PBMC 大鼠外周血单个核细胞 Rat PBMC 小鼠外周血单个核细胞 Mouse PBMC 兔外周血单个核细胞 Rabbit PBMC 猪外周血单个核细胞 Pig PBMC 关    于    我    们 汇智和源,致力于为创新药研发企业及生命科学研究机构提供高品质的生物试剂,IPHASE为公司核心品牌,品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。 购    买    方    式: 电话:400-127-6686 微信:直接扫描右侧微信二维码添加购买
地址:北京市北京经济技术开发区科创十四街
汇龙森18号楼1单元301
电话:400-127-6686
电子邮件:support@iphasebio.com

咨询
提交


400-127-6686
support@iphasebio.com
Copyright © 2021 北京汇智和源生物技术有限公司  京ICP备10015565号  网站支持:中企动力