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体内碱性彗星试验常见问题——《药物遗传毒性研究技术指导原则》

2021-10-15

（六）体内碱性彗星试验（In vivo mammalian alkaline comet assay）
1.动物
通常采用健康年轻性成熟的啮齿类动物，给药起始年龄6～10周龄。啮齿类动物种属选择应采用在毒性试验中使用的种属，致癌性试验中可致肿瘤的种属，或者与人类代谢最相关的种属。常采用大鼠，如果科学合理也可采用其他种属。
彗星试验关于雌性动物的试验数据很少，参考其他体内遗传毒性试验，可采用一种性别进行试验，如雄性。若性别间存在明显的毒性或代谢方面的差异，则应采用两种性别的动物，可分析动物数每组雌雄至少各5只。如果受试物拟专用于一种性别，可采用相应性别的动物进行试验。
2.剂量
至少应设置3个剂量组。
根据相关毒性试验或预试验的结果确定高剂量，可采用最大耐受量（MTD）、最大给药量、最大暴露量或限度剂量为最高剂量。对于低毒性化合物，给药时间<14天的推荐最高剂量为2000mg/kg/天，给药时间≥14天的推荐最高剂量为1000mg/kg/天。最高剂量之下的剂量以合适的剂量间距递减以研究剂量-反应关系，且剂量应优选能覆盖产生最大毒性到少/无毒性的剂量范围。当在所有剂量均观察到靶组织毒性，建议在无毒性剂量下进一步研究。为更充分地研究剂量-反应曲线的形状可能需要附加剂量组。
3.对照
应设立平行阴性（空白对照和/或溶剂对照）和阳性对照组。阳性对照物应为已知的阳性诱变剂。
4.方法
给药方案：可采用每天给药一次，给药2天或更多天。受试物的给药途径应尽可能与临床拟用途径相同，阴性对照物应与受试物给药途径一致，阳性对照物的给药途径可以不同于受试物。
采样：采样时间对于彗星试验非常关键。采样时间由受试物达到靶组织中最大浓度所需的时间，以及诱导DNA链断裂但在这些断裂被清除、修复或细胞死亡之前来确定。彗星试验所能检测到的引起DNA断裂的一些损伤的持续时间可能非常短，因此，如果怀疑这种短暂的DNA损伤，应采取措施确保组织被尽早采样，以减少这种丢失。若可获得，应由药动学数据[如血浆或组织浓度达峰时间（Tmax）或多次给药后达到稳态浓度]来确定采样时间。若无药动学数据，采样时间在2次或更多次给药的末次给药后的2～6小时，或单次给药后的2～6小时和16～26小时两个时间点。若可获得，靶器官毒性作用表现也可用于选择合适的采样时间。
应明确说明组织选择的合理性，组织选择应根据进行该项试验的理由、受试物已有的药动学（ADME）信息、遗传毒性、致癌性和其他毒性信息等来确定，考虑的重要因素包括受试物的给药途径、预测的组织分布和吸收、代谢的作用、可能的作用机制等。由于肝脏是外源性代谢的主要部位且常常高暴露于受试物和其代谢产物，在缺乏背景信息且未确定特殊关注组织的情况下，可选择肝脏作为研究组织。在一些情况下，可选择受试物直接接触部位进行研究。
样品处理：样品处理过程极为关键，应严格控制试验条件，进行充分的方法学验证。取所选择组织，制备单细胞悬液，单细胞制备后尽快完成制片（理想的是1小时内）。所有玻片的裂解条件应保持恒定，低温（约2～8℃）避光裂解至少1小时（或过夜）。强碱条件下（pH≥13），解旋至少20分钟，在控制条件下进行电泳。电泳的电压应保持恒定，其他参数的变异应保持在狭窄和特定的范围内；解旋和电泳过程中应维持低温（通常为2～10℃）。
读片分析：采用自动化或半自动化图像分析系统进行阅片，对彗星进行定量评价。
细胞可分为三类：可评分细胞、不可评分细胞和刺猬样细胞（hedgehog）。
对可评分细胞（具有清晰的头部和尾部，不干扰邻近细胞）的尾DNA百分率[% tail DNA，也称尾强度百分率（% tail intensity）]进行评价，来反映DNA链断裂。每个动物样本应至少对150个可评分细胞进行测定。
刺猬样细胞是严重损伤的细胞，无法通过图像分析系统进行可靠测量，应单独评价刺猬样细胞。每个动物样本应至少对150个细胞进行观察并单独记录，计算刺猬样细胞百分率。
5.结果判定
结果中应描述各剂量组的毒性大小，包括一般症状，以及刺猬样细胞百分率。结果表示为各剂量组的尾DNA百分率（%tail DNA）（首选指标）、尾长或尾矩。
除了遗传毒性外，靶组织毒性也可导致DNA迁移增加，故结果分析时需区分遗传毒性和细胞毒性。可通过组织病理学变化来反映细胞毒性，如炎症、细胞浸润、凋亡或坏死性变化与DNA迁移增加有关，血液生化学指标的改变（如AST、ALT等）也可提供细胞毒性的信息。
受试物所诱发的尾DNA百分率与同期阴性对照组相比至少一个剂量组显著升高、升高具有剂量依赖性，且在阴性对照历史范围之外，可判定为阳性结果。
如果结果不是明确的阳性或阴性，或者为了确定阳性结果的生物学意义，应进行专家同行评议和/或进一步研究，如分析更多的细胞（当可行时），或者采用优化的试验条件进行重复试验（如改变试验剂量间距、其他给药途径、其他采样时间或其他组织）。
对于阴性结果，需提供支持靶组织暴露或毒性的直接或间接证据。为评价阳性或可疑结果的生物学意义，需提供靶组织细胞毒性信息。