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体外哺乳动物细胞染色体畸变试验常见问题——《药物遗传毒性研究技术指导原则》

2021-10-15

(二)体外哺乳动物细胞染色体畸变试验(In vitro mammalian chromosomal aberration test)
1.细胞
可采用哺乳动物或人的细胞进行试验,如CHL细胞、CHO细胞、TK6细胞、人外周血淋巴细胞等,细胞系需定期检查核型和有无支原体污染等。-80℃或液氮冻存备用。
2.浓度
至少应包含3个可用于结果分析的浓度。
最高浓度主要取决于受试物的细胞毒性和/或溶解度。
(1)对于可溶性的无细胞毒性的受试物,推荐的最高浓度一般为1 mM或0.5 mg/ml (选用较低者)。
(2)对于可溶性的有细胞毒性的受试物,应根据细胞毒性大小确定最高浓度。最高浓度所产生的细胞毒性应达到约50%但无需超过50%。对于哺乳动物细胞,可采用相对群体倍增数(Relative population doubling,RPD)和相对细胞增长数(Relative increase in cell count,RICC)的减少来反映细胞毒性;对培养的人外周血淋巴细胞,可通过有丝分裂指数(Mitotic Index,MI)的降低来反映细胞毒性。 
(3)对于难溶性的受试物,一般采用最小沉淀浓度为最高浓度。
对最高浓度之下的其他浓度,对于细胞毒性小或无的受试物,一般浓度间距为2~3倍;对于有细胞毒性的受试物,所选择的浓度应覆盖产生细胞毒性的范围,并且包括具有中度或少/无细胞毒性的浓度;在一些情况下,如具有较陡峭的浓度反应关系,则可适当缩小浓度间距或将检测的浓度加至3个以上。
每一浓度一般平行2皿;若能获得足够细胞数,可用单皿,尤其当超过3个检测浓度时。
3.代谢活化
一般采用诱导剂,如Aroclor 1254或苯巴比妥和β-萘黄酮联合诱导处理后的哺乳动物肝脏微粒体酶(S9)进行体外代谢活化试验,即在加S9和不加S9平行条件下测试。S9在试验介质中的终浓度一般为1%~10%(v/v)。
4.对照
代谢活化或非代谢活化条件下,均应设立平行阴性(空白对照和/或溶剂对照)和阳性对照组。阳性对照物应为已知的阳性诱变剂。
5.方法
处理及细胞收获时间:在代谢活化或非代谢活化条件下,受试物和细胞作用3~6小时,在1.5个正常细胞周期时收获细胞;在非代谢活化条件下,受试物和细胞还应持续作用至1.5个正常细胞周期时收获细胞。对于某些受试物,与细胞接触时间/收获细胞时间可能要大于1.5个正常细胞周期。
读片分析:一般油镜下每种浓度至少观察300个分散良好的分裂中期相细胞,若观察到大量染色体畸变细胞,分析细胞数可相应减少。应分别记录各组含有结构畸变染色体的细胞数和畸变类型,染色单体型与染色体型畸变应分别记录并记录亚型(断裂、交换)。裂隙应单独记录,但不计入畸变率中。同时应单独记录多倍体和内复制等数目畸变,但不计入畸变率中。
6.结果判定
结果中应描述各浓度组细胞毒性大小和沉淀情况;结果表示为染色体结构畸变细胞的百分率。
受试物在任一处理条件下至少一个浓度时染色体畸变率显著升高,升高具有浓度依赖性,且畸变率在阴性对照历史范围之外,可判定为阳性结果。结果判定时应首先考虑试验结果的生物学意义,统计学分析有助于结果的评价。
如果结果不是明确的阳性或阴性结果,或者为了帮助确定结果的生物学意义,应对数据进行专家同行评议和/或进一步研究。分析更多的细胞(当可行时),或者通过改变试验条件进行重复试验(如改变试验浓度间距、改变代谢活化条件等)可能是有用的。
应单独记录多倍体和内复制的发生率。多倍体数目的增加提示受试物可能会抑制有丝分裂或诱导染色体数目畸变。出现染色体内复制的细胞数增多提示受试物可能会影响细胞周期。

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