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IPHASE/汇智和源 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验热点问题解答【上】
2023-11-03
体外哺乳动物细胞染色体畸变试验常见问题与解答
—热点问题—
Q:细胞被“黑胶虫”污染了该如何处理?
A:
如果培养的细胞被“黑胶虫”污染,需先去评估污染的严重程度。如果污染不严重,可选用市售的“黑胶虫”清除试剂进行处理;如果污染较严重,建议直接丢弃该细胞,分析造成“黑胶虫”污染的原因并进行治理。
Q:
CHL细胞为试验系统,细胞准备时推荐的接种密度是多大?接种后培养多久可以开始染毒?
A:
本公司使用T25瓶进行试验,接种密度为6~9×10^4/mL,接种量为5mL,即每瓶细胞量是3×10^5个~4.5×10^5个。一般情况下,接种后24h左右细胞的融合率可达到80%即可进行染毒,如果融合率不够,也可以继续培养直至满足试验需求。
Q:
一般如何确定秋水仙素的浓度和处理时间啊?
A:
秋水仙素剂量大,则作用时间短;秋水仙素剂量小,则适当延长作用时间。本公司使用的秋水仙素浓度是1μg/mL,4h。
Q:
秋水仙素工作的机理是什么?
A:
秋水仙素可以抑制纺锤体的形成,导致纺锤丝无法捕捉到着丝粒而造成染色体不能向细胞两极移动。同时,秋水仙素处理后,染色体将会不能排列在赤道板,所以在细胞中会散乱分布。
Q:
细胞收集量少是什么原因导致的?如何优化?
A:
细胞收集量少的原因主要有以下几点:
(1)酶消化过程消化不干净;
(2)离心速度过低,细胞不能沉淀,导致细胞丢失;
(3)铺板细胞量不够;
(4)样品对细胞有毒性,细胞死亡。
优化策略:
(1)酶消化过程需于显微镜下观察,确保消化完全;
(2)适宜的离心条件,通常250g,5min;
(3)细胞悬液需混合均匀,必要时多次计数;
(4)如有需求,请于正式试验前开展预试验。
Q:
低渗目的是什么?有什么注意事项?
A:
在低渗环境中,细胞易吸水膨胀,染色体铺展,以便能在一个平面上观察所有染色体形态,为后续染色做准备。在低渗过程中我们需要注意以下几点:
(1)低渗时间。低渗时间过长,可引起细胞破裂,染色体丢失;低渗时间不足,细胞膨胀度不够,染色体聚集,分散不好,不利于阅片。本公司低渗是使用0.075mol/L的氯化钾溶液37℃水浴30~40min。
(2) 细胞操作需轻柔。低渗后的细胞会胀大,通透性增强,细胞操作过程一定要轻柔,以防细胞破裂。
(3)离心条件需适合。低渗后细胞膨胀,离心力过高,细胞容易破裂,导致染色体丢失;离心力过低,细胞不能沉淀,收集不到细胞。
Q:
细胞在固定过程中丢失是什么原因导致的?
A:
细胞在固定过程中丢失可能是因为离心速度过低,细胞不能沉淀或沉淀不够,在更换固定液的过程中导致细胞丢失。
Q:
每次固定的时间是多久?固定几次比较合适?
A:
本公司使用的是预固定加重复固定的方法。预固定在低渗结束前进行,一般3~5min,步骤虽简单却不能省略,可有效预防细胞因加入大量的固定液而凝结成块。固定步骤共重复3次,一般30±5min。
Q:
玻片干燥怎么操作?
A:
可于室温下自然干燥,也可于37℃干燥箱中烘干。
Q:
使用吉姆萨染液同样条件下染片,为什么会出现有的片子是蓝色的,有的是红色的?
A:
根本原因是因为染色过程中pH的变化。吉姆萨染液由天青,伊红组成,所带电荷随溶液PH而定。在偏酸性环境中下在电荷增多易与伊红结合染色偏红;在偏碱性环境中负电荷增多,易与美蓝或天青结合,染色偏蓝。
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