药物转运体的研究方法

Methods for the study of drug transporters

作者单位

李 聃, 盛 莉 , 李 燕

中国医学科学院

北京协和医学院药物研究所药物代谢室

天然药物活性物质与功能国家重点实验室

活性物质发现与适药化研究北京市重点实验室

摘 要

位于细胞膜上的转运体是体内重要的功能性膜蛋白 , 在药物吸收、分布、代谢及排泄的动力学过程中发挥重要作用。

转运体的功能缺失或抑制是引起药物相互作用及某些疾病的重要原因。

了解转运体的功能对阐明药物的体内药代动力学特征、药效及毒性具有重要意义。

本文对目前常用的主要药物转运体的研究方法进行综述。

正文

药物转运体是位于细胞膜上的功能性膜蛋白。

人体内参与药物跨膜的转运体种类众多 , 按底物跨膜转运方向可分为参与药物吸收和外排的两大类转运体。

吸收转运体：

介导药物进入细胞的转运体可将底物摄取至靶位以发挥药效, 属于可溶性载体 (solutecarrier, SLC),

主要包括氨基酸转运体 (L-type amino transporter, LAT)、

寡肽转运体 (peptide transporters, PEPTs)、

钠依赖性续发性主动转运体 (sodium dependent secondary active transporters, SGLTs) 、

钠非依赖性易化扩散转运体(sodium-independent facilitated diffusion transporters,GLUTs)、

一元羧酸转运体 (monocar-boxylate transporter,MCT)、

有机阴离子 (organic anion transporters, OATs)

及阳离子转运体 (organic cation transporters, OCTs)等 。

外排转运体：

介导药物外排的转运体主要包括

P糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)、

多药耐药相关蛋白 (multidrug resistance associated proteins, MRPs)、

乳腺癌耐药蛋白 (breast cancer resistance protein, BCRP)

及胆酸盐外排泵 (bile salt export pump, BSEP),

属于ATP结合盒转运体 (ATP binding cassette, ABC) 家族, 可利用水解ATP的能量对药物及内源性物质进行转运。

近年来, 随着分子生物学技术的发展, 药物转运体研究取得重大进展。

多种药物已被证明是转运体的底物或抑制剂。

已知LAT的底物包括抗帕金森药左旋多巴，抗癫痫药多巴喷丁。

左旋溶肉瘤素等抗肿瘤药也可抑制肿瘤细胞LAT的活性。

PEPT可识别寡肽及类似结构分子,如β-内酰胺抗生素、抗病毒药伐昔洛韦、血管紧张素转化酶抑制剂福辛普利、肾素抑制剂等均可被PEPT识别而经小肠吸收。

根皮苷、达格列净则可通过抑制SGLT,阻断近曲小管对葡萄糖的重吸收。

OATP1A2的底物包括强心苷类药奎巴因、抗组胺药非索非那定及有机阳离子阿片肽、维库溴铵等。

他汀类、青霉素、甲氨蝶呤、缬沙坦等属于OATP1B1的底物,而环孢素、沙奎那韦、利福平及某些黄酮类化合物可抑制OATP1B1的转运功能。

OCT主要负责转运亲水性、低分子量有机阳离子,其典型底物如二甲双胍及奥沙利铂,抑制剂如奎宁、丙吡胺。

OCT2的典型底物还包括雷尼替丁、阿米洛利和普萘洛尔,甲腈咪呱、西替利嗪均可显著抑制OCT2的转运活性。

P-gp的底物多是疏水性阳离子,维拉帕米、环孢素A可竞争P-gp结合位点,抑制或阻断P-gp的外排功能。

MRP的底物包括多种抗癌药如甲氨蝶呤、依托泊苷、米托蒽醌及血管紧张素受体拮抗剂,环孢素、依法韦仑、恩曲他滨可抑制MRP对底物的外排功能。

BCRP的底物包括普伐他汀及多种植物雌激素,而雌二醇是BCRP的特异性抑制剂。

上述转运体可不同程度地影响药物的吸收、分布、排泄及药物相互作用。

明确药物的转运机制有利于提高药物的安全性和有效性,指导临床合理用药。

因此,转运体在药物研究中的重要性日益引起关注。

本文旨在介绍目前常用的转运体体外、在体及体内研究方法,以期为新药设计、提高药物靶向性及药物相互作用等研究提供借鉴。

体外模型

1

体外细胞模型

体外细胞模型是研究药物转运特性的重要手段，主要包括不含重组转运体的细胞系、原代细胞、三明治培养原代肝细胞模型、转染细胞。

细胞模型在药物发现阶段可用于确定药物是否为单一或多个转运体的底物或抑制剂、药物转运机制及跨膜转运的限速步骤。

此外, 上述细胞体系还可用于转运体介导的药物−药物相互作用研究。

1.1 不含重组转运体的细胞系

来源于不同种属的多种细胞系可用于转运体研究,如Caco-2、MDCK、Caki、IHKE-1、NRK52E、LLC-PK1细胞等。

Caco-2细胞模型被认为是目前最理想的体外吸收模型,可作为快速评估新药吸收和转运特性的方法。

Caco-2细胞来源于人结肠癌细胞,与人小肠上皮细胞结构相似,MDR1、MRP2、PEPT1和OATP-B等多种转运体在Caco-2细胞中表达水平均较高。将药物与Caco-2细胞培养一定时间后测定细胞内药物含量,可反映肠道对药物的吸收。

Shan等采用Caco-2细胞作为药物肠道吸收模型,研究P-gp抑制剂粉防己碱(tetrandrine,Tet)对黄连素(berberine,BBR)的吸收促进作用。

当Caco-2细胞培养体系中同时加入Tet和BBR时,细胞中BBR的蓄积量较单独加入BBR有显著提高,证实Tet可通过抑制P-gp,改善BBR的肠道吸收。

Transwell小室模型可测定药物经细胞的跨膜转运,反映药物肠道转运的渗透性。

将状态良好的细胞接种于Transwell小室聚碳酯膜上,待细胞形成单层后,可通过测定碱性磷酸酶活性或细胞层电阻值等方法检查细胞通透性和完整性,根据公式计算表观渗透系数(Papp)。

通常吸收较差药物(<1%)的Papp<1×10−7cm·s−1,吸收为1%～100%的药物Papp为0.1×10−6～1×10−6cm·s−1,而吸收良好药物的Papp>1×10−6cm·s−1。

Shanmugam等用Caco-2细胞评价促渗透剂对肠道渗透性的改善,提高扎那米韦(zanamivir,ZMR)的生物利用度。

结果表明,在癸酸钠(200mmol·L−1)作用下,ZMR的Papp值高于对照组6倍,肠道渗透性显著提高。

Caco-2细胞模型应用于转运体研究具有诸多优越性,如与人同源性好;易于培养;细胞内含有代谢酶,可在代谢条件下测定药物摄取和跨膜转运等。

此模型应用于预测药物被动转运相关性最为理想,只有部分载体介导主动转运药物可以用该模型预测。

Caco-2细胞模型也存在一定局限性,如Hilgendorf等分别将人肠组织和Caco-2细胞中的转运蛋白表达水平进行定量比较,发现Caco-2细胞中PEPT1、BCRP、MDR1、MRP2的表达水平显著低于人肠组织,因此当应用Caco-2细胞研究以上转运体时应考虑这一因素。

1.2 原代细胞

原代细胞来源于完整组织,可表达存于该组织的全部转运体基因,与体内模型相关性较好,可用于研究药物代谢、转运及临床药物的相互作用。

原代细胞分离后需适应培养环境,以确保细胞适度生长,转运体恰当表达及定位。

原代肝细胞可完整表达肝脏药物代谢酶和转运体,是评价经肝药物转运、代谢及毒性最常用的模型之一。

HepaRG虽然保留了原代肝细胞的许多特征,包括关键药物代谢酶和转运体,但在培养一段时间后会丧失代谢及转运能力。

Ulvestad等研究发现,原代肝细胞OATP1B1的转运活性至少可持续7天,而HepaRG培养2天后OATP1B1丧失活性。

体外评价模型能够长期保持转运及代谢活性十分重要,因此原代肝细胞相对于HepaRG细胞更具优势。

原代肝细胞培养过程中摄取转运体表达较为稳定,而外排转运体表达随培养时间延长有增加趋势,因此该模型多适用于摄取转运体研究。

游离肝细胞培养技术是研究转运体功能的另一重要手段。

将放射性标记底物和抑制剂与肝细胞共同孵育后裂解肝细胞,测定放射强度以反映释出药物的肝细胞摄取率。

Ishiguro等采用大鼠游离肝细胞证实了OATP参与替米沙坦的肝摄取,该过程是Na+依赖性且可被OATP底物兼抑制剂牛黄胆酸盐、普伐他汀和地高辛所抑制,但不能被有机阳离子四乙胺所抑制,说明多种OATPs可能参与替米沙坦的转运,OCTs则不参与。

游离肝细胞模型的特点是可避免其他组织器官对肝细胞的影响,更易控制实验条件。

与肝灌流技术相比,该技术可利用同源肝细胞进行重复实验,即对照组与实验组来源于同一动物,重复性好。

与肝切片相比,游离肝细胞生化特性完整,可保留细胞内代谢酶,避免切片对肝细胞造成的功能损伤。

与亚细胞组分相比,保持了完整细胞的结构,更接近体内环境。尽管具有以上诸多优势,由于失去肝小叶、肝内胆管等结构,游离肝细胞不能完全替代整体动物转运体功能的评价。

脑微血管内皮细胞(brainmicrovascularendothelial cells，BMECs)是血脑屏障(blood brain barrier, BBB)的主要组成部分。

体外培养原代BMECs可保留体内细胞的主要特点,如OATP及P-gp表达丰富,能在体外融合成致密的单层细胞等,因此可用于体外BBB转运体的研究。

Batrakova等用牛原代BMECs细胞作为体外BBB模型，研究普朗尼克嵌段共聚物P85对P-gp底物转运的影响，发现普朗尼克嵌段共聚物P85可显著抑制脑微血管P-gp外排转运功能,增加P-gp底物的转运。

血管内皮细胞在人体多种生理病理过程中发挥重要作用,通常选用原代脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEs)进行转运研究。

Jin等利用HUVEs研究飞燕草素葡萄糖苷(delphinidin-3-glucoside,Dp)通过内皮细胞的转运,发现Dp摄取进入内皮细胞的过程是由钠依赖性葡萄糖转运体(sodium dependent glucose transporter1, SGLT1)介导,且转运过程具有温度、浓度及时间依赖性, SGLT1底物葡萄糖、SGLT1抑制剂根皮苷可显著抑制Dp的转运。

1.3 三明治培养原代肝细胞模型

已知肝细胞中除了含有丰富的药物代谢酶, 还表达多种重要的摄取和外排转运体。

虽然原代肝细胞可模拟肝脏基本功能,然而传统方法培养的肝细胞会迅速丧失极性及代谢能力, 失去胆管网络, 难以模拟体内肝的小管外排功能。

三明治培养是将肝细胞培养于两层胶原之间,底层铺鼠尾胶使肝细胞贴壁, 上层铺Matrigen胶使其形成肝板样结构, 可维持肝细胞极化状态, 保持肝细胞的代谢活性及调节机制, 得以最大程度地模拟肝脏功能。

培养几天后, 肝细胞形成完整胆小管网络并同时保持紧密连接, 且肝脏转运体正常表达并定位于恰当的膜区域, 可用于转运体功能研究。

当细胞在含Ca2+的标准缓冲液中孵育时, 紧密连接体完整, 摄取进入肝细胞的药物可在转运体作用下外排至胆管; 当细胞在无Ca2+缓冲液中孵育时, 紧密连接体遭到破坏, 管腔内药物扩散进入细胞培养液中。

因此, 通过在含Ca2+和无Ca2+条件下测定药物细胞蓄积量的差值可计算排入胆管的药量。

Annaert等采用三明治培养大鼠肝细胞(sandwich-cultured rat hepatocytes, SCRH)研究了P-gp参与的药物胆汁排泄, 以P-gp底物罗丹明123(Rh123)和地高辛作为模型药物, 通过测定有Ca2+和无Ca2+条件下Rh123和地高辛的蓄积量, 确定排入胆管的药量。

在P-gp抑制剂依克立达(GF120918)作用下两药的胆汁排泄率均减小, 且应用SCRH所得的胆汁清除率值与在体大鼠肝灌流、游离肝细胞实验所得数值基本吻合,由此确定P-gp在两药胆汁排泄中的作用。

研究者进一步采用SCRH研究肝脏转运体介导的药物相互作用, 考察P-gp调节剂对Rh123胆管外排指数(BEI)、胆汁清除率(CLbile)的影响。

通过比较有无调节剂的BEI和CLbile值可推断转运相互作用发生在基底侧还是胆小管膜, 进而阐明肝脏药物转运相互作用的潜在机制。

P-gp诱导剂地塞米松(10μmol·L−1)可使CLbile显著提高而BEI值不变,说明地塞米松对P-gp的诱导发生在基底侧,而诱导剂利福平(5～50μmol·L−1)可同时提高BEI和CLbile,提示利福平对P-gp的诱导发生在胆小管膜侧。

与目前常用的MDR1-MDCK、Caco-2等单层细胞模型相比,SCRH模型能更好地模拟体内环境,可同时考察转运体与药物代谢酶的相互作用。

用于预测药物胆汁排泄以及基于转运体的药物相互作用,并可与动物体内试验结果进行相关分析。

1.4 转染细胞

将重组转运体基因稳定或瞬时转染于不同细胞系,可用于研究转运体功能及药物相互作用。

转染细胞系可单独表达吸收和外排转运体,或者二者共表达。

用于构建转染细胞的细胞系众多,如MDCK、HEK239、LLC-PK1和CHO细胞系等。

构建过程包括将含目的基因片段的重组质粒转染至特定细胞,用G418进行筛选,挑选单克隆细胞后结合

Western Blot、PCR、免疫荧光显微镜或放射性标记底物摄取/外排率等方法验证转染细胞是否构建成功。

Yang等分别用OAT4、OATP1A2、URAT1基因转染CHO及HEK293细胞,成功构建OAT4/CHO、OATP1A2/HEK293、URAT1/HEK293细胞模型, 研究3种转运体对底物全氟辛酸(pentadeca fluoro octanoic acid,PFO)的转运,发现OAT4和URAT1可参与PFO的吸收。

除了单转染细胞系,稳定转染双转运体的极化细胞目前也得到广泛应用,如在细胞基底侧膜转染吸收转运体,在基顶侧膜转染外排转运体。

König等构建了MDCK-OCT1-MATE1、MDCK-OCT2-MATE1双转染细胞模型,并用相应的单转运体转染细胞作为对照,研究二甲双胍和甲基−苯基−吡啶阳离子(MPP+)的转运机制,证实OCT1、OCT2介导两个药物的摄取转运,而MATE1介导外排。

上述方法不但能考察介导每种底物转运的转运体,同时可研究多种转运体的相互作用。

一般认为,单转染细胞通常缺乏内源性吸收或外排转运体,无法模拟药物分子跨膜转运的完整机制,而双转染细胞在一定程度上克服了这一缺陷。

然而在完整器官中,某些化合物的转运可能是由多种转运体所介导, 即使双转染细胞也无法全面预测体内转运的真实过程, 进而有研究者构建了三重转染细胞,如Hirouchi等构建的OATP1B1/MRP2/MRP3、OATP1B1/MRP2/MRP4三转染细胞用于研究药物经过转运体的矢量转运。

对某些药物而言,药物相互作用的产生不仅来自转运体,而是药物代谢酶和转运体的共同作用,如外排转运体和CYP3A4协同降低共同底物的吸收。

Kwatra等构建了P-gp和CYP3A4双转染的MDCK细胞系(MMC), 两种基因的表达及功能验证表明MDCK细胞适用于同时表达这两种基因, 并用该细胞系验证P-gp及CYP3A4协同发挥作用限制共同底物的吸收。

双转染细胞系由于保留了转运体和代谢酶的高度协同作用,对转运体和药物相互作用的研究具有更高价值。

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基于膜的体外模型

2.1ATP酶测定法

ATP水解法可用于研究某些底物和抑制剂与ABC转运体的相互作用。

ABC转运体需要利用ATP分解产生的能量进行物质转运, 因此将底物分别与含P-gp、MRP、BCRP转运体的细胞或组织温孵, 利用比色法测定转运过程中ATP裂解产生的无机磷酸盐, 可以反映药物转运机制。

此种分析方法简便易行, 可应用于高通量筛选, 批量分析与ABC转运体相互作用的化合物。

该技术的缺点包括:对某些底物和抑制剂来说, ATP酶的活性与转运速率不一致;容易出现假阳性或假阴性结果;底物需要较高的浓度。

故该法一般不单独应用于ABC底物或抑制剂的筛选。

2.2 膜囊泡转运模型

该模型将膜囊泡混悬于含药缓冲液中,模拟药物吸收,包括刷状缘膜囊泡(BBMV)、基底膜囊泡和外翻转囊泡模型。

BBMV法是将禁食动物小肠取出,沉淀离心处理肠细胞匀浆,得到的沉淀物具有刷状缘酶和载体活性。

将所得沉淀物重新混悬,得到囊泡,测定囊泡摄取的药物,模拟药物吸收。

Liu等采用家兔BBMV模型证实抗肝炎药JBP485及其衍生物JBP923均能抑制PEPT1典型底物甘氨酰肌氨酸的转运,故这两个化合物在肠道的转运也是由PEPT1所介导。

BBMV和基底膜囊泡联合应用, 可以同时研究肠细胞顶侧膜和基底膜的转运。该方法实验时间短, 囊泡制备方便,适合新化合物早期高通量筛选。

外翻转膜囊泡模型主要用于外排转运体的研究, 尤其是ABC转运体。

囊泡外翻后, 转运体暴露在囊泡表面, 与药物共同温孵时, 转运体可以将药物转运到囊泡内, 测定囊泡内药物含量可反映转运体对药物的作用。

多种细胞可用于制备膜囊泡, 如转染细胞及杆状病毒感染的昆虫细胞。

采用外翻转膜囊泡模型进行研究时, 分析体系需含有ATP再生系统以维持分析期内能量持续供应, 且应采用5'-AMP替代ATP的体系作为阴性对照。

与转染细胞模型相比, 该模型除减少了细胞培养步骤、操作简便外, 更主要的优点是如果化合物分子量大、不易透过细胞膜时, 细胞模型将无法研究药物的转运机制, 而外翻转膜囊泡模型则不受化合物渗透性的影响。

此外, 药物直接作用于外翻转膜上的转运蛋白, 可检测药物的吸收而非外排, 计算吸收动力学参数, 用于目标转运体底物或抑制剂定量构效关系分析(quantitative structure activity relationship,QSAR)。

值得注意的是,该方法不适用于研究疏水性底物的转运,因该类化合物易与囊泡或细胞内的膜结构结合,导致背景增高。

在对疏水性底物进行囊泡转运分析时,需先应用不同的排阻技术以减小背景干扰。

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肾切片摄取模型

肾切片摄取模型是将麻醉大鼠肾脏取出,切成厚度约为300μm的切片,将该切片置于通氧的水浴中温孵,加入待测药物,测定摄取药量。

Liu等静脉注射顺铂诱导大鼠急性肾衰竭,应用肾切片模型研究JBP485改善急性肾衰竭的作用。

研究可见,大鼠静脉注射顺铂后,血中对氨马尿酸(para-amino hippurate,PAH)含量显著升高,PAH的AUC和t1/2分别是对照组的2.2倍和1.9倍,肾切片实验结果显示PAH摄取显著降低。

顺铂诱导大鼠给予JBP485后可降低肌酸酐、血尿素氮,恢复肾小球滤过率,促进毒性代谢产物排出。

qRT-PCR和Western-blot测定证实顺铂诱导大鼠OAT1、OAT3表达减少,且MRP2表达量增加,而给予JBP485后MRP2表达量进一步增加,提示JBP485通过上调外排转运体,促进毒性代谢产物排出。

肾切片模型可研究药物是否为肾脏转运体的底物,预测化合物的肾转运特点。

该方法的局限性在于仅能考察肾脏分泌型转运体,由于缺乏完整的肾小管网络,不适于重吸收转运体的研究。

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外翻肠囊模型

外翻肠囊模型是由刷状缘膜囊泡和体外小肠肠环培养技术发展而来。

将大鼠麻醉后分离小肠, 用缓冲液将小肠洗净, 外翻, 使肠粘膜暴露在外侧,结扎小肠末端。

分离得到的肠段可采用乳酸脱氢酶法或台盼蓝法对肠粘膜细胞活性进行评价。

在肠腔内加入培养液,将肠段放入含有药物的培养液中, 持续通氧培养一定时间后, 取培养液测定药物浓度, 以肠囊内外药物浓度变化反映肠道转运体的参与程度。

Hamilton等应用外翻肠囊法对SGLT1进行了系统研究, 包括SGLT1的Na+依赖特性、抑制剂及Na+-K+-ATP酶在转运过程中的作用。

研究发现,SGLT1是一种典型的继发型转运体,利用Na+进入细胞产生的电化学梯度引起细胞内葡萄糖蓄积,而Na+电化学梯度的产生和维持依赖于Na+-K+-ATP酶。

该方法实验条件易控,操作简单,经济实用且重复性好,被广泛应用于转运体转运机制、营养物质吸收及药代动力学的研究。

由于缺乏体内肠蠕动状态、血液供应和消化道细胞代谢特性,用该方法所得的结果与体内生理状态仍存在一定偏差。

在体模型

目前广泛应用的动物在体肝、肠及脑灌流模型可分别用于肝脏、肠道、脑部转运体的研究。

在体器官灌流模型通过在灌流液中加入转运体的选择性抑制剂, 比较灌流液、组织器官或血浆中药物含量的差别, 考察转运体对药物的吸收或外排作用。

通过比较单个或多个药物联合灌流的结果, 可研究合用药物对同一转运体的竞争而影响药物吸收。

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在体肠灌流模型

禁食大鼠胆管结扎并分离肠段,将插管与肠端相连并结扎,灌流管与插管连接后进行在体肠段灌流。

用含药灌流液进行灌流后不同时间点采集肝门静脉血测定药物浓度。

肠灌流可保持血液供应、肠道药物代谢酶的活性、神经及内分泌的完整性,可较好反映生理条件下药物在肠道吸收。

Zhang等采用大鼠在体肠灌流模型发现JBP485与头孢氨苄(OATP底物)合用后较单独给药在门静脉内浓度降低,证实两药合用后由于竞争OATP而影响了药物吸收。

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在体脑灌流模型

脑灌流模型用于研究药物经BBB及血眼屏障的转运机制,灵敏度极高,不但保持了器官的完整性、生理条件下的位置及状态,且避免了药物与血浆蛋白的结合及外围器官的代谢。

该技术通过直接向通往脑部的颈动脉灌流,待测物质以已知浓度加入到灌流液中,测定进入脑内药量,计算相关参数,分析药物脑部转运特征。

脑灌流模型手术完成后需以14C或3H标记的蔗糖进行短暂灌流,以检测BBB的完整性并计算血管容量。

Tournier等采用小鼠在体脑灌流模型评价了ABC和OATP转运体对格列苯脲(glyburide,GLB)转运的贡献。

灌流液中同时或单独加入P-gp、BCRP、MRP及OATP抑制剂的研究发现,P-gp及BCRP协同限制GLB入脑,另外可能还存在MRP4的外排转运,而OATP不参与GLB的转运。

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在体肝灌流模型

大鼠在体肝灌流不影响药物被其他器官的代谢和消除,是一种评价药物转运过程的理想模型。

You等采用大鼠在体肝灌流模型研究MTC-220在肝脏的转运机制, 当灌流液中加入OATP抑制剂利福平时, MTC-220的肝脏摄取率与对照组相比显著降低, 当灌流液中分别加入丙磺舒(MRP2抑制剂)、新生霉素(BCRP抑制剂)及维拉帕米(P-gp抑制剂)时, MTC-220的胆汁排泄率显著降低,

提示OATP可能涉及MTC-220的肝脏摄取,MRP2、BCRP及P-gp可能参与MTC-220的外排。

体内模型

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基因敲除小鼠

Schinkel等[28]采用转基因技术构建了mdr1a(−/−)小鼠,该种小鼠无明显生理缺陷,但不表达P-gp。

mdr1a(−/−)小鼠限制药物脑部暴露量, 作用高于P-gp抑制剂伊维菌素100倍。

此后基因敲除动物模型种类日益丰富,商品化应用逐渐完善, 成为目前研究转运体功能的重要工具之一。

为证实P-gp及BCRP对共同底物的透过具有协同作用, Kodaira等将P-gp底物奎尼丁给予Bcrp(−/−)小鼠, BCRP底物丹曲林给予Mdr1a/1b(−/−)小鼠, 与野生型小鼠比较两药的脑、睾丸与血浆的浓度比(Cbrain/Cplasma,Ctestis/Cplasma)。

结果显示,P-gp、BCRP的单独缺失不会引起丹曲林或奎尼丁Cbrain/Cplasma、Ctestis/Cplasma明显改变, 即不会影响BCRP、P-gp外排功能。

研究者进一步采用双基因敲除小鼠研究P-gp和BCRP共同底物埃替特罗、夫拉平度及米托蒽醌的外排作用, 3种底物在Mdr1a/1b(−/−)/Bcrp(−/−)小鼠体内的Cbrain/Cplasma及Ctestis/CplasmaMdr1a/1b(−/−)、Bcrp(−/−)小鼠有明显提高。

由此可见, P-gp及BCRP在介导底物外排方面具有协同作用, 当某一转运体单独缺失时,不会引起底物外排率的明显改变。

此外, 将各基因型缺陷小鼠的Cbrain/Cplasma及Ctestis/Cplasma分别与野生型进行比较,P-gp对共同底物的外排贡献大于BCRP。

基因敲除小鼠用于转运体的研究具有以下特点:

①可阐明生理条件下的转运体功能,如对主要血液−组织屏障的保护作用;

②无需抑制剂即可研究转运体对药物的摄取和外排;

③可用于多转运体协同作用的研究。

但其存在问题也需注意。

已有研究者对Mdr1a、Bcrp及Mrp2基因敲除小鼠在小肠、肝、肾、脑组织的基因表达及病理学改变进行了系统研究。

结果显示, Mrp2基因敲除小鼠表现出高胆红素血症及肝脏Mrp3上调, 小鼠肝细胞体积增大, 清除器官重量增加会导致药物清除增加。

因此, 在应用基因敲除小鼠进行转运体功能研究时, 基因敲除引起小鼠代偿性功能改变进而导致药物代谢动力学的变化需引起关注。

此外, 基因敲除模型种类有限、价格昂贵及种属间差异,使得该技术难以应用于转运体底物及抑制剂的高通量筛选。

随着研究者对转运体功能研究的重视, 会有更多类型的转运体基因敲除动物模型出现,进一步促进药物转运的研究。

基因敲除动物模型是研究缺失转运体的转运机制及药物在组织中富集、药效发挥的理想模型,对于寻找新的转运体抑制剂也十分有用。

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抑制剂“敲除”转运体

体内实验方法除采用普通动物与基因敲除动物作对比实验外, 也常用选择性抑制剂抑制转运体功能,达到“敲除”转运体的目的, 考察药物在抑制剂组和对照组动物体内吸收和代谢差别,从整体动物水平研究转运体对药物的作用。

Matsuda等采用P-gp和BCRP的特异性抑制Zosuquidar(ZSQ)、Ko143研究了P-gp及BCRP共同底物拓扑替康(topotecan, TPT)的转运机制及单个转运体对TPT转运的影响。

结果显示,BCRP对TPT的外排能力是P-gp的3倍。

用抑制剂“敲除”转运体是一种方便快捷的研究转运体的方法,但存在抑制剂特异性不高,价格较高等问题,未来的研究中还需开发特异性高且价格相对便宜的抑制剂。

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小动物活体成像技术

动物活体成像技术是在不损伤动物的前提下,应用影像学方法对生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性定量研究。

该技术主要分为核素成像、光学成像(opticalimaging)、计算机断层摄影(computed tomography,CT)、核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)和超声(ultrasound)成像。

其中光学成像和核素成像的灵敏度和精确性极高,特别适合研究药物代谢和转运等生理过程,称为功能成像。

核素成像是用放射性核素示踪的方法显示体内结构,按所用核物理探测方法不同分为正电子发射断层显像(positron emission tomography,PET)和单光子发射断层显像(single photon emission computed tomography,SPET)。

研究肿瘤细胞中BCRP及P-gp功能时,PET技术较为常用。

Yamasaki等将高表达BCRP及P-gp的Caco-2细胞导入小鼠体内,在抑制剂存在或缺失的情况下应用PET扫描,比较BCRP与P-gp共同底物[11C]GF120918的摄取率。

当给予抑制剂时,[11C]GF120918的摄取率显著提高,由此证实GF120918在肿瘤细胞中的转运是经P-gp和BCRP转运体所介导。

体内光学成像包括荧光与生物发光两种技术。

荧光技术采用荧光染料(包括荧光量子点)或荧光报告基因(GFP、RFP)等纳米标记材料进行标记,利用荧光蛋白质或染料产生的荧光、报告基因产生的生物发光可形成体内生物光源。

Pichler等采用RNAi技术下调肿瘤细胞中P-gp的表达,用P-gp底物海肾荧光素酶作为成像探针,应用荧光成像技术观察到海肾荧光素酶在肿瘤细胞中的摄取率高于对照组4倍。

可见光成像具有无辐射、使用低能量、实时监测活体生物体内细胞活动和基因行为,对信号检测灵敏度高等优势。

随着可见光成像技术的迅速发展,成像探针不断更新,在药物转运体研究中的应用会更加广泛。

结 语

体内存在的转运体对药物跨膜转运起决定作用,可影响药物的体内过程及药物间相互作用。

本文将目前常用的转运体研究技术进行分类介绍并归纳各自优缺点(表1), 研究者在对某一转运体进行研究时需综合考虑各方面因素, 选取适合的方法。

表 1 转运体研究方法及其优缺点比较

由于体内转运机制复杂,影响因素很多, 采用单一方法了解某一或某些转运体的功能是不够的,往往需要权衡各类方法的利弊, 多种方法联合应用, 所得结果相互佐证,综合分析及验证。

随着新药研发新技术的出现、分子生物学及计算机技术的发展,会有更多、更高效、灵敏的转运体研究方法出现, 对了解新化合物的体内过程、结构修饰、转运体所介导的药物相互作用、提高药物生物利用度、降低药物不良反应及临床合理用药提供更为全面科学的依据。

来源：药学学报

Acta Pharmaceutica Sinica 2014, 49 (7): 963−970

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