外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC），是指外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞（Lymphocyte）、单核细胞（Monocyte）、树突状细胞（DC）和其他少量细胞。PBMC可通过健康人或动物供体的外周血，通过Ficoll密度梯度离心法（IPHASE/汇智和源），磁珠分选等步骤获得。
　　Ficoll是蔗糖的多聚体，中性，平均分子量400,000，当密度为1.2g/mL，未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。

一、外周血单个核细胞（PBMC）制备方法
1.设备与试剂
全血 （以10ml为例）
无菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理盐水
蔗糖溶液（Ficoll Pague PLUS) 
RPMI 1640培养基 
胎牛血清（FBS）
双抗P/S （Penicillin/ Streptomycin) 
二甲亚砜（DMSO）
预先装好异丙醇的冻存盒

2.方法/步骤
配制所需的溶液：
a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；
b. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO；

（1）将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；
（2）取两支15ml离心管，先加入5ml Ficoll溶液。然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合在一起，每只离心管各10ml稀释血液；
（3）2,000rpm，20min，注意，降速设置中一定要设置成no break，或者只有1-2成的制动。离心完毕将得到如图所示分层；
（4）PBMC所在细胞层为白色。此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml离心管中。
（5）加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min离心后去掉上清，再加入培养基进行相同操作的清洗；
（6）加入5-10ml培养基重悬细胞，进行后续计数培养或者铺板；
（7）细胞冻存：将细胞离心收集之后，用细胞冻存液重悬。取1-1.5ml细胞至冻存管中，放入冻存盒（冻存盒可事先在4℃冰箱预冷）。再将冻存盒放置于-80℃冰箱过夜。第二天将细胞转入液氮中长期保存。

IPHASE/汇智和源建议操作注意事项
（1）全血溶液可以加在Ficoll上层或者下层，但是最终都必须保证两种溶液分层清晰。
（2）分离PBMC第一步离心的时候，一定不能设置或设置低水平的制动。否则将分层混乱。
（3）人PBMC和动物PBMC分离方法稍有不同，动物PBMC需求可联系IPHASE/汇智和源。

细胞运输与保存
（1）干冰运输，收到细胞后立即转入液氮冻存或直接复苏；
（2）T25瓶运输的新鲜细胞，收到后应继续生长，传代达到细胞生长状态良好时，再进行冻存，具体操作步骤见细胞培养步骤。

PBMC收到后注意事项
（1）收到PBMC细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时反馈。
（2）先不打开瓶盖，瓶身擦拭酒精后放培养箱静置四小时，稳定细胞状态，切忌在温箱内静置过夜。
（3）静置后镜检，拍照，记录细胞状态。建议传代后也拍照记录细胞生长情况。
（4）贴壁细胞：若细胞密度超过80%，可正常传代；若未超过80%，收集细胞瓶内的培养基，留8ml继续培养至80%左右再传代，瓶盖可稍微拧松。
（5）细胞瓶内的培养基含血清和双抗，可收集后4℃保存备用，可补加2%血清。刚开始传代时建议一半用细胞瓶内的培养基，一半用自备的培养基，使细胞逐渐适应培养条件，以免因不适应而造成生长状态不佳。
（6）细胞胰酶消化液建议使用PBS配制。

IPHASE/汇智和源其他外周血单个核细胞：
人外周血单个核细胞 Human PBMC
猴外周血单个核细胞 Monkey PBMC
比格犬外周血单个核细胞 Dog PBMC
大鼠外周血单个核细胞 Rat PBMC
小鼠外周血单个核细胞 Mouse PBMC
兔外周血单个核细胞 Rabbit PBMC
猪外周血单个核细胞 Pig PBMC

关    于    我    们

汇智和源，致力于为创新药研发企业及生命科学研究机构提供高品质的生物试剂，IPHASE为公司核心品牌，品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。

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