Ficoll密度梯度离心法提取PBMC原理及注意事项 2022-06-23

外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC），是指外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞（Lymphocyte）、单核细胞（Monocyte）、树突状细胞（DC）和其他少量细胞。PBMC可通过健康人或动物供体的外周血，通过Ficoll密度梯度离心法（IPHASE/汇智和源），磁珠分选等步骤获得。 　　Ficoll是蔗糖的多聚体，中性，平均分子量400,000，当密度为1.2g/mL，未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。 人PBMC中不同细胞类型的比例 PBMC中大部分都是淋巴细胞，包括B细胞和T细胞，其中CD3 T细胞又占了淋巴细胞中绝大部分(45-70%)。这些T细胞都处于初始（naive）状态，即已经成熟了但没有受到抗原刺激。 在正常人中，只有非常小的一部分初始T细胞会因抗原识别而被激活。同样的B细胞也都处于初始状态。相对于淋巴细胞，单核细胞的比例在10-30%，收到刺激之后会发育成树突状细胞(DC)或巨噬细胞。干细胞的比例非常低，只有0.1-0.2%，因此很难从全血样本中分离到。 一、外周血单个核细胞（PBMC）制备方法 1.设备与试剂 全血 （以10ml为例） 无菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理盐水 蔗糖溶液（Ficoll Pague PLUS)  RPMI 1640培养基  胎牛血清（FBS） 双抗P/S （Penicillin/ Streptomycin)  二甲亚砜（DMSO） 预先装好异丙醇的冻存盒 2.方法/步骤 配制所需的溶液： a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S； b. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO； （1）将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀； （2）取两支15ml离心管，先加入5ml Ficoll溶液。然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合在一起，每只离心管各10ml稀释血液； （3）2,000rpm，20min，注意，降速设置中一定要设置成no break，或者只有1-2成的制动。离心完毕将得到如图所示分层； （4）PBMC所在细胞层为白色。此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml离心管中。 （5）加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min离心后去掉上清，再加入培养基进行相同操作的清洗； （6）加入5-10ml培养基重悬细胞，进行后续计数培养或者铺板； （7）细胞冻存：将细胞离心收集之后，用细胞冻存液重悬。取1-1.5ml细胞至冻存管中，放入冻存盒（冻存盒可事先在4℃冰箱预冷）。再将冻存盒放置于-80℃冰箱过夜。第二天将细胞转入液氮中长期保存。 IPHASE/汇智和源建议操作注意事项 （1）全血溶液可以加在Ficoll上层或者下层，但是最终都必须保证两种溶液分层清晰。 （2）分离PBMC第一步离心的时候，一定不能设置或设置低水平的制动。否则将分层混乱。 （3）人PBMC和动物PBMC分离方法稍有不同，动物PBMC需求可联系IPHASE/汇智和源。 细胞运输与保存 （1）干冰运输，收到细胞后立即转入液氮冻存或直接复苏； （2）T25瓶运输的新鲜细胞，收到后应继续生长，传代达到细胞生长状态良好时，再进行冻存，具体操作步骤见细胞培养步骤。 PBMC收到后注意事项 （1）收到PBMC细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时反馈。 （2）先不打开瓶盖，瓶身擦拭酒精后放培养箱静置四小时，稳定细胞状态，切忌在温箱内静置过夜。 （3）静置后镜检，拍照，记录细胞状态。建议传代后也拍照记录细胞生长情况。 （4）贴壁细胞：若细胞密度超过80%，可正常传代；若未超过80%，收集细胞瓶内的培养基，留8ml继续培养至80%左右再传代，瓶盖可稍微拧松。 （5）细胞瓶内的培养基含血清和双抗，可收集后4℃保存备用，可补加2%血清。刚开始传代时建议一半用细胞瓶内的培养基，一半用自备的培养基，使细胞逐渐适应培养条件，以免因不适应而造成生长状态不佳。 （6）细胞胰酶消化液建议使用PBS配制。 IPHASE/汇智和源其他外周血单个核细胞： 人外周血单个核细胞 Human PBMC 猴外周血单个核细胞 Monkey PBMC 比格犬外周血单个核细胞 Dog PBMC 大鼠外周血单个核细胞 Rat PBMC 小鼠外周血单个核细胞 Mouse PBMC 兔外周血单个核细胞 Rabbit PBMC 猪外周血单个核细胞 Pig PBMC 关    于    我    们 汇智和源，致力于为创新药研发企业及生命科学研究机构提供高品质的生物试剂，IPHASE为公司核心品牌，品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。 购    买    方    式： 电话：400-127-6686 微信：直接扫描右侧微信二维码添加购买

Ficoll密度梯度离心法分离PBMC 2022-06-22

外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC），是指外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞（Lymphocyte）、单核细胞（Monocyte）、树突状细胞（DC）和其他少量细胞。 1     原理 单个核细胞的体积、形态和比重与外周血其它细胞不同，红细胞和多核白细胞的比重超过1.080，单个核细胞的比重为1.070左右，血小板为1.030左右。因此，可利用各种血细胞和单个核细胞比重之间的差异将各种血细胞与单个核细胞分离开来。 Ficoll密度梯度离心法是分离、纯化PBMC最常用的方法。Ficoll是蔗糖的多聚体，中性，平均分子量400000，当密度为1.2g/mL，未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜，故常用作PBMC分离的分离液。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分离液比重，离心后漂浮于分离液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分离液中。吸取分层液液面上的白膜层细胞，并进行适当的清洗，就可从外周血中分离到较高纯度的单个核细胞，即PBMC。 2     方法 1）取新鲜抗凝全血，按照1：1比例加入1×稀释洗涤液，将血液进行稀释（以降低血液粘稠度），轻柔混匀，备用。 2）向无菌离心管内加入适量的单个核细胞分离液，将稀释后的血样平铺到分离液液面上方（分离液：稀释全血=1：2），保持两液面界面清晰。  3）800g，室温，离心 20min-30min（注：设置较慢的加速度和减速度，如果有十档，设为第三档）。  4）离心结束后，吸弃血浆层，小心吸取PBMC层（即白膜层）并转移至15mL离心管中。离心结束后，管内液面从上至下依次为稀释血浆层、PBMC层、分离液层和红细胞层（见图1）。  图1 稀释外周血离心前后的分层状态图 5） 向离心管中加入10mL 的1×稀释洗涤液重悬细胞，250g，室温离心 10min ，弃上清。重复该步骤 1~2 次，即可用于后续试验。 3     注意事项 1）不同种属动物单个核细胞的比重有一定差异，请选择合适的分离液进行PBMC的分离。 2）血液新鲜程度是影响分离效果的关键因素，请尽量使用采集后24h内的血液进行PBMC分离。 3）为保证细胞的活力，整个操作过程请轻柔，避免对细胞造成机械性的损伤。 4）为保持细胞状态良好，请尽量缩短整个试验的周期。 4     相关产品 关    于    我    们 汇智和源，致力于为创新药研发企业及生命科学研究机构提供高品质的生物试剂，IPHASE为公司核心品牌，品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。 购    买    方    式： 电话：400-127-6686 微信：直接扫描右侧微信二维码添加购买

CYP450酶代谢表型研究(化学抑制法)原理及实验方法 2022-06-17

1    概述 1.1 药物代谢研究简介 药物代谢研究是创新药物研发的重要内容，它不仅决定了创新药物制剂研发的成败，而且与创新药物研发的速度和质量有密切关系。因而，药物代谢研究在新药研发工程中具有不可或缺的重要作用，研究药物代谢对于了解药物在体内的变化过程至关重要。 药物代谢研究的方法主要分为体内和体外两种。体内代谢法因药物在生物体内的分布较广，加上代谢转化的器官和酶系的多样性，使药物及其代谢产物在体内的浓度比较低，代谢产物的检测具有一定的困难。体外代谢法在短时间内可以得到大量的代谢产物，且代谢条件可控，代谢体系比较“干净”，代谢物易于分离、提取，有利于代谢途径研究及代谢产物结果的确定等，因而，体外代谢法具有突出的优越性。 由于肝脏是药物代谢的主要场所，体外代谢模型多以肝脏为基础。目前，研究体外代谢方法主要有：肝微粒体体外温孵法、重组P450酶体外温孵法、肝细胞体外温孵法、肝脏离体灌流法和肝切片法。其中，肝微粒体体外温孵法与其他体外代谢方法相比，酶制备简单，代谢过程快，重现性好，易大量操作，同时可用于药物代谢酶的抑制及体外清除等方面的研究，因而在实际工作中应用较为普遍。 1.2 CYP450酶代谢表型研究的重要性 药物代谢酶表型鉴定，主要是研究参与药物清除的代谢酶的类型、数量和相对贡献率。如果药物主要通过单一的代谢途径对药物进行清除，可能会存在很大的用药风险；相反，如果某一药物的代谢过程涉及的代谢酶越多，则说明其代谢途径也越多，也就难以发生潜在的药物-药物相互作用，使得患者之间的治疗偏差降低。因此，在新药临床前研究中，对药物的代谢酶表型进行鉴定，获得其主要代谢酶的消除比例，阐明参与药物体内代谢转化的相关酶亚型，对于研究药物的代谢机制，预测药物代谢多态性和药物间相互作用等方面具有重要意义。 1.3 CYP450酶及代谢表型研究方法 CYP450为一类含亚铁血红素蛋白的超家族，根据相关酶亚型在药物代谢中的重要程度，可将CYP450分为以下三类：（1）主要CYP450，包括CYP1A2、CYP2C9 、CYP2C19 、CYP2D6 和CYP3A4；（2）较主要CYP450，包括CYP2B6、CYP2C8和CYP3A5；（3）次要CYP450，包括CYP1A1、CYP1B1、CYP2A6、CYP2E1、CYP2J2和CYP4A11等。参与药物代谢的动物肝微粒体P450酶较为复杂，而人肝微粒体中参与药物代谢的P450酶相对比较简单，主要有CYP1A、CYP2C、CYP2D、CYP2E和CYP3A，其组成见图1。 图1 人肝内P450酶的组成 目前，CYP450的酶表型鉴定主要使用以下3种方法：选择性抑制法、重组人源CYP450同工酶法、相关性分析法。选择性抑制法又分为化学抑制法和抗体抑制法，即在加入和不加入一系类CYP450酶亚型选择性化学抑制剂或抗体的条件下，分别测定人肝微粒体对药物的代谢活性，以考察人肝微粒体中CYP450酶亚型倍选择性抑制后，药物的代谢是否受到影响，从而计算相对抑制百分率，推断CYP450酶代谢表型。其中，化学抑制法由于其操作简单，且价格低廉而得到广泛应用。 2    实验原理 参与药物代谢的CYP450酶主要为CYP1、CYP2和CYP3三个家族，其中CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4/5是主要的药物代谢酶。CYP2B6和CYP2C19在体外没有特异性的选择性抑制可用，一般还需结合重组酶法进行其表型确定。噻氯匹定是CYP2B6的抑制剂，诺卡酮是CYP2C19的抑制剂，α-奈黄酮为CYP1A2的特异的选择性抑制剂，槲皮素为CYP2C8的特异的选择性抑制剂，磺胺苯吡唑为CYP2C9的特异的选择性抑制剂，奎尼丁为CYP2D6的特异的选择性抑制剂，酮康唑为CYP3A4/5的特异的选择性抑制剂，如选用特异的选择性抑制剂抑制不同亚型的酶的活性，便可通过化学抑制法研究药物的CYP450酶代谢表型。 3    实验方法描述 肝微粒体体外温孵法是采用肝微粒体，辅以NADPH再生系统（IPHASE汇智和源），在体外模拟生理环境条件进行代谢反应，经过一定时间的反应后，采用HPLC、LC-MC和LC-MC/MC等测定温孵液中原型药物或其代谢产物的浓度，分析其主要代谢途径。 3.1 肝微粒体制备 P450酶主要在肝脏中表达，肝脏中的P450酶在体外是以微粒体的形式存在的。微粒体是指在细胞匀浆和差速离心过程中获得的由破碎的内质网自我融合形成的近似球形的膜囊泡状结构，是异质性的集合体。它包含内质网膜和核糖体两种基本成分，在体外实验中具有蛋白质合成、蛋白质糖基化和脂类合成等内质网的基本功能。目前，制备肝微粒体常用的方法是差速离心法。具体制备流程见下图（图2）： 图2 肝微粒体制备流程图 3.2 体外孵育体系的建立 CYP450酶代谢表型研究的肝微粒体体外孵育体系，是由制备的肝微粒体辅以氧化还原型辅酶，再加入酶特异的选择性抑制剂，在模拟生理温度及生理环境的条件下进行生化反应的体系。 推荐使用的孵育体系为：每个孵育体系总体积为200 µL，体系包括0.1M PH 7.4 的磷酸缓冲液，汇智和源NADPH再生系统（1mM NADP，5 mM的6-磷酸葡萄糖，1 U/mL 6-磷酸葡萄糖脱氢酶，3.3 mM的氯化镁）；适当浓度的肝微粒体蛋白；适量的选择性抑制剂；合适浓度的待测物，于37°C水浴孵育，每个样品平行3次，以不加选择性抑制剂组为对照。于预设的反应时间点，加入等体积预冷的乙腈终止反应。 3.3 原型药物或代谢产物的检测 采用HPLC、LC-MC和LC-MC/MC等测定温孵液中原型药物或其代谢产物的浓度。 例： 下图（图3、图4、图5）为研究某一候选药物的CYP450酶代谢表型的实验，该实验采用选择性化学抑制剂的方法分析了该药物在鼠、犬和人肝微粒体中的代谢情况，从而判断微粒体中哪些CYP450亚型是该药物的主要代谢酶。 数据计算： 用待测物的消除速率表示待测物在微粒体孵育体系中的代谢速率。 抑制率%=（1- 加入抑制剂样品代谢速率/空白对照样品代谢速率）×100% 图3 大鼠肝微粒中某药物的代谢抑制率 图4 犬肝微粒中某药物的代谢抑制率 图5 人肝微粒中某药物的代谢抑制率 从上图可知，不同种属微粒体中，该候选药物的代谢抑制率存在差异。表明，不同种属微粒体中参与该候选药物代谢的酶亚型可能不同。 4    CYP450酶代谢表型研究试剂盒简介 本公司针对CYP450酶代谢表型研究的需要，以肝微粒体体外温孵法为指导，以化学抑制法为基础，开发了一款专门用于CYP450酶代谢表型研究的试剂盒，该产品可直接用于药物CYP450酶代谢表型研究，省去了肝微粒体制备和试剂配制的繁琐过程，大大缩短了实验周期，且试剂盒各组成成分经过严格的质量检测，符合CYP450酶代谢表型研究试验要求，实验结果准确、可靠、重现性好。 4.1 产品说明 本产品提供了采用化学抑制法进行CYP450酶代谢表型研究的所有试剂，可直接用于药物CYP450酶代谢表型的研究，省去了试剂配制的繁琐过程，且试剂盒各组成成分经过严格的质量检测，实验结果准确、可靠、重现性好。 根据微粒体种属的不同，可根据实际需求选择人肝微粒体、恒河猴肝微粒体、比格犬肝微粒体、大鼠肝微粒体和小鼠肝微粒体中的一种。 4.2 试剂盒优势 便捷——本试剂盒省去了肝微粒体制备和试剂配制时间，可以直接使用，大大缩短了实验周期。 准确——本试剂盒各成分均经过严格的质量检测，实验结果准确、可靠、重现性高。 稳定——本试剂盒稳定性强、易于运输和保存。 4.3 产品组成 50反应/盒，200μL/反应。 4.4 产品使用说明 4.4.1 试验组 1）冰浴融化试剂盒各组分，置于冰上待用； 2）除微粒体外，将孵育体系其它各组分按照配比混合并吹吸混匀，于37℃预孵育5min； 3）将以上混合液195μL/管分装至2.0mL离心管中，于37℃水浴中保温， 5μL/反应加入肝微粒体，吹吸3次混匀于37℃水浴条件下启动代谢反应，使用秒表计时； 4）于设定孵育时间点，向孵育体系中加入终止液终止反应（如预冷乙腈，预冷乙腈体积：孵育体系体积=1:1）。 例：200μL孵育体系配制： 注：a.体系中有机溶剂加入量不得大于1%； b.若实际需要n个孵育体系，则需配置n＋1个体系。 4.4.2对照组： 1）阳性底物组：反应体系中不加选择性抑制剂，并将受试物换为阳性底物，其它组分加入量不变，缺少体积用0.1M PBS缓冲液补齐； 2）无抑制剂组：反应体系中不加选择性抑制剂，其它组分加入量不变，缺少体积用0.1M PBS缓冲液补齐； 无A、B液组：反应体系中不加A液和B液，其它组分加入量不变，缺少体积用0.1M PBS缓冲液补齐。 4.4.3结果计算： 采用底物消除法评价试验结果，用待测物的消除速率表示待测物在微粒体孵育体系中的代谢速率； 抑制率%=（1-加入抑制剂样品代谢速率/无抑制剂组样品代谢速率）×100% 4.5 使用注意事项 1）试验开始前，请自行准备2.0mL离心管、不同规格枪头、37℃水浴锅等； 2）本产品仅供科研使用，不能用于人体及动物的治疗或临床诊断； 3）使用前，需于冰浴条件下解冻并混合均匀； 4）于-70℃冰箱冷冻保存，切勿反复冻融； 5）在使用过程中，也可根据实际实验需求调整试剂盒使用方法和各组分的加入量； 6）因CYP2B6和CYP2C19在体外没有绝对特异的抑制剂可用，故结果分析还需结合其它结果进行，如重组酶法的结果。 关    于    我    们 汇智和源，致力于为创新药研发企业及生命科学研究机构提供高品质的生物试剂，IPHASE为公司核心品牌，品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。 购    买    方    式： 电话：400-127-6686 微信：直接扫描右侧微信二维码添加购买

血浆稳定性试验的血浆怎么选 2022-06-15

1    血浆稳定性研究的意义 1.1 血浆稳定性研究的重要性 在药物发现过程中，先导化合物的代谢稳定性（包括肝代谢稳定性和血浆稳定性等）是影响其成药性的关键因素。在药物研发案例中，很多先导化合物都存在稳定性差的问题，而很多具有良好药理活性的化合物由于不够稳定最终导致研发失败而终止。因此，代谢稳定性研究是寻找候选药物过程中不可或缺的一项重要内容。 尽管化合物的肝代谢稳定性被普遍认为是药物发现过程中所面临的最主要的挑战之一，但是化合物的血浆稳定性仍然是新药研发过程中一个重要的影响因素。化合物的血浆稳定性与肝代谢稳定性有时并不一致，这是一个经常被人们忽视的问题。肝脏中的代谢酶和血液中的代谢酶不同，在体外稳定性评估中，化合物在肝代谢酶中稳定，并不能代表它在血浆中也稳定。因此，研究先导化合物的血浆稳定性对于新药研发同样具有重要意义。 1.2 血浆稳定性数据的应用 1.2.1 分析化合物体内稳定性差的原因 化合物体内稳定性差有时候不能归因于肝代谢稳定性差，如果化合物含有易被水解的官能团，血浆稳定性差可能是其被清除的主要原因。在新药研发过程中只关注化合物的肝代谢稳定性而忽视其血浆稳定性，就可能无法有效的解决化合物在体内稳定性差的问题。血浆稳定性数据可作为化合物体内稳定性差的有力证据，为结果分析提供数据支持。 1.2.2提示化合物不稳定结构 当化合物和血浆中的某种水解酶具有一定亲和力的时候，其结构中特定的官能团就会被水解酶水解，从而导致具有生物活性的化合物在血浆中的浓度迅速降低，以致无法发挥有效的治疗作用。血浆稳定性数据可以直观的反应出化合物可能会出现的稳定性问题，这将有助于研究人员挑选稳定性更好的化合物或对现有化合物进行结构改造并进行后续研究。 1.2.3筛选前药和软药 血浆稳定性并非有弊无益，研究人员可以利用其降解特性来进行前药和软药的设计优化，筛选前药和软药。为了提高化合物的渗透性和代谢稳定性，可以采用前药策略，增加进入血液的前药浓度，使得前药在血液中水解并释放出活性成分。另外，还可利用药物的血浆降解特性试剂软药，使药物在完成治疗作用后，按预先设定的代谢途径和可以控制的速率分解、失活并迅速排出体外，从而避免药物的蓄积毒性。 2    血浆在血浆稳定性试验中的重要性 血浆是血液的重要组成部分，其主要成分是水、血浆蛋白、葡萄糖、激素、矿质离子以及多种水解酶等。血浆中含有多种水解酶，例如胆碱酯酶、醛缩酶、脂肪酶、脱氢肽酶、碱性和酸性磷酸酶等。在血浆中易被降解的官能团主要有酯基、酰胺、氨基甲酸酯、内酰胺、内酯、磺酰胺以及肽类结构等。因此，化合物自身结构、血浆中水解酶的含量和活性等是影响化合物在血浆中稳定性的主要因素。 然而，血浆中水解酶的含量和活性取决于动物种属、性别、年龄和健康状态等。 ① 动物种属差异：化合物在不同种属之间的血浆稳定性有时也存在较大差异，这可能与不同种属中水解酶的活性、含量以及结构差异有关。一般情况下，化合物在啮齿类动物体内的稳定性要低于人体内的稳定性。 ② 性别差异：同一种属雌雄动物血浆中的蛋白浓度存在差异，可能会影响到血浆稳定性试验的结果。 ③ 年龄差异：血浆容量及其组成随年龄而改变，故年龄是影响血浆稳定性的一个重要因素。 ④ 健康状态：动物的健康状态会严重影响到血浆中酶的活性和含量。 因此，高质量的血浆供应是确保血浆稳定性试验结果稳定、可靠的前提。 3    IPHASE产品优势 IPHASE/汇智和源根据血浆稳定性试验的需求，筛选出了符合试验要求的血浆，为试验的顺利进行提供了保障。 l  多种属 本公司可提供猴、犬、大鼠、小鼠等种属不同抗凝剂的血浆，满足客户需求。 l  特定采血方式 本公司提供的血浆可通过心脏采集的血液分离而来，更适用于血浆稳定性试验。 l  安全性 采集血浆的动物均经过传染源的检测，使用更安全、放心。 l  溯源性 本公司血浆产品均可提供溯源性证明，为客户免除了后顾之忧。 l  质控数据齐全 本公司根据不同种属血浆的特性，选择适宜的阳性药物（见表1）进行血浆中水解酶活性的评估，为试验结果的准确有效提供了保障。 表1 阳性药在血浆质量评估中的使用 l  可定制 除常规种属血浆外，本公司还可根据客户需求，提供特殊种属血浆的定制服务。 4    相关产品 IPHASE/汇智和源凭借多年的研发经验，推出了多领域、多种类的高端科研试剂，为药物早期研发提供筛选工具，为生命科学领域的探索提供新材料、新方法和新手段，为食品、药品、化学品等的遗传毒性研究提供便捷产品。 关    于    我    们 汇智和源，致力于为创新药研发企业及生命科学研究机构提供高品质的生物试剂，IPHASE为公司核心品牌，品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。 购    买    方    式： 电话：400-127-6686 微信：直接扫描右侧微信二维码添加购买

外周血单个核细胞（PBMC）制备方法及注意事项 2022-06-14

外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC），是指外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞（Lymphocyte）、单核细胞（Monocyte）、树突状细胞（DC）和其他少量细胞。PBMC 可利用健康人或动物供体的外周血，通过 Ficoll 密度梯度离心，磁珠分选等步骤获得，主要包括淋巴细胞和单核细胞。 Ficoll 是蔗糖的多聚体，中性，平均分子量 400,000，当密度为 1.2 g/mL，未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。 人 PBMC 中不同细胞类型的比例 PBMC 中大部分都是淋巴细胞，包括 B 细胞和 T 细胞，其中 CD3 T 细胞又占了淋巴细胞中绝大部分 (45 - 70%)。这些 T 细胞都处于初始（naive）状态，即已经成熟了但没有受到抗原刺激。 在正常人中，只有非常小的一部分初始 T 细胞会因抗原识别而被激活。同样的 B 细胞也都处于初始状态。相对于淋巴细胞，单核细胞的比例在 10 - 30%，收到刺激之后会发育成树突状细胞 (DC) 或巨噬细胞。干细胞的比例非常低，只有 0.1 - 0.2%，因此很难从全血样本中分离到。 一、外周血单个核细胞（PBMC）制备方法 1. 设备与试剂 全血（以 10 ml 为例） 无菌 PBS 溶液 (pH7.4) 或者生理盐水 蔗糖溶液（Ficoll Pague PLUS) (GE Healthcare Life Sciences #17 - 1440 - 02) RPMI 1640 培养基（Invitrogen） 胎牛血清（FBS）（GIBCO） 双抗 P/S（Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO) 二甲亚砜（DMSO）（SIGMA） 预先装好异丙醇的冻存盒 2. 方法/步骤 配制所需的溶液： a. 细胞培养基：RPMI 1640 + 10% FBS+ 1% P/S； b. 细胞冻存液：FBS 中加入 10%DMSO； （1）在离心管中加入淋巴细胞分离液 Ficoll （2）取抗凝外周血（全血）与无菌 PBS 按照 1:1 充分混匀，用移液管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，动作一定要轻，注意保持清楚的界面。外周血，PBS，淋巴细胞分离液最终体积比为 1:1:1。 （3）水平离心 400 g 成×30 分钟（可根据淋巴细胞分离液 Ficoll 或离心机转子要求调整） （4）离心后可看见管内分为三层，上层为血浆和 PBS，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液。在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，主要就是单个核细胞，包括淋巴细胞与单核细胞。此外，还含有血小板。 （5）去除部分上层液体，余下约 1 mL，用移液器插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一离心管中，加入 5 倍以上体积的 PBS，离心 300 g×10 分钟，洗涤细胞两次。 （6）末次离心后，弃上清，加入红细胞裂解液，室温孵育 2 分钟，裂解红细胞，可根据情况适当增减时间。 （7）加入 10 mLPBS，离心 300 g×10 分钟，洗涤细胞两次。 （8）末次离心后，弃上清，加入含有 10%FBS 的 RPMI1640，重悬细胞，计数，计算细胞活力。 注意事项 全血溶液可以加在 Ficoll 上层或者下层，但是最终都必须保证两种溶液分层清晰。 分离 PBMC 第一步离心的时候，一定不能设置或设置低水平的制动。否则将分层混乱。 细胞运输与保存 （1）干冰运输，收到细胞后立即转入液氮冻存或直接复苏； （2）T25 瓶运输细胞，收到后应继续生长，传代达到细胞生长状态良好时，再进行冻存，具体操作步骤见细胞培养步骤。 PBMC 收到后注意事项： （1）收到 PBMC 细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时反馈。 （2）先不打开瓶盖，瓶身擦拭酒精后放培养箱静置四小时，稳定细胞状态，切忌在温箱内静置过夜。 （3）静置后镜检，拍照，记录细胞状态。建议传代后也拍照记录细胞生长情况。 （4）贴壁细胞：若细胞密度超过 80%，可正常传代；若未超过 80%，收集细胞瓶内的培养基，留 8 ml 继续培养至 80% 左右再传代，瓶盖可稍微拧松。 （5）细胞瓶内的培养基含血清和双抗，可收集后 4℃ 保存备用，可补加 2% 血清。刚开始传代时建议一半用细胞瓶内的培养基，一半用自备的培养基，使细胞逐渐适应培养条件，以免因不适应而造成生长状态不佳。 （6）细胞胰酶消化液建议使用 PBS 配制。 IPHASE可提供人，猴，犬，大鼠，小鼠等不同种属外周血单个核细胞（PBMC），CD3 +，CD4 +，CD38 +，CD14 +，CD19 +等分选细胞，可按照客户需求多个批次，多个供体细胞。 不同种属 PBMC：人，猴，犬，大鼠，小鼠 人外周血单个核细胞 PBMC Fresh/Frozen 猴外周血单个核细胞 PBMC Fresh/Frozen 比格犬外周血单个核细胞 PBMC Fresh/Frozen 大鼠外周血单个核细胞 PBMC Fresh/Frozen 小鼠外周血单个核细胞 PBMC Fresh/Frozen 购买方式： 电话：400-127-6686 微信：直接扫描右侧微信二维码添加购买

空白生物基质 —— 生物样本分析方法学验证套装 2022-06-14

1    空白生物基质 采自健康受试者或者健康实验动物的空白全血、血清、血浆、胆汁、乳汁、尿液、粪便、肠道内容物、组织脏器、玻璃体液、房水、脑脊液等多种类型的生物基质，统称为空白生物基质。 2    空白生物基质应用 在生物基质分析方法的建立和验证中，需要使用空白生物基质，确保分析方法的准确性及可靠性。空白基质主要用于配制校正标样、制备质控样品用于考察分析方法的特异性、选择性、精密度、准确度、基质效应、回收率、稳定性、稀释线性、干扰效应等。其中检测方法的选择性和基质效应对于空白基质的要求更高。 选择性：是分析方法在空白生物基质中存在潜干扰物质（非特异性干扰）的情况下区分和测定待测物的能力 。 高脂基质选择性的评价应使用至少一种来源的高脂基质。用于验证的基质应尽可能代表实际的试验样品。应尽量从甘油三酯水平异常高的受试者中获得。如果难以获得，虽然不能完全代表实际试验样品，也可以使用加入甘油三酯的基质。 溶血基质选择性的评价应使用至少一种来源的溶血基质，可通过向基质中添加溶血全血（至少 2% V/V）获得，以形成明显可检测的溶血样品。基质效应：基质效应是指由于生物基质中的干扰物质和未识别的成分引起的待测物响应的改变。在方法验证过程中，需要考察不同来源/批次间空白生物基质可能产生的基质效应。 表1 业界主流生物分析方法学验证指导原则关于选择性的描述 表2 业界主流生物分析方法学验证指导原则关于基质效应的描述 3    IPHASE空白基质产品 1)  外源性物质检测常用生物基质 基质类型包括：全血，血清，血浆（不同抗凝剂），脑脊液，乳汁，尿液，胆汁，胃液，粪便，肝组织，脑组织，肾组织，肺组织，卵巢组织，角膜组织，房水，玻璃体液，组织匀浆液等。动物种属包括：食蟹猴，恒河猴，比格犬，SD大鼠，Wistar大鼠，Wistar Han大鼠，ICR（CD-1）小鼠，C57小鼠，Balb/c小鼠，金黄地鼠，豚鼠，小型猪，兔，猫，牛，羊等。 均可提供未用药声明，传染源检测，供体来源等信息，满足各类法规对于空白基质溯源性要求。 2)  内源性物质检测常用生物基质 人工全血、血浆、脑脊液、胃液、小肠液、尿液等。可提供质控报告（含产品成分列表），满足各类法规对于空白基质溯源性要求。 4    新品推介 根据目前业界主流生物分析方法指导原则的要求（详见表1，表2），特推出空白生物基质方法学验证套装，标配6或10个不同供体/批次的主要的空白生物基质见表3。 表3 验证套装产品介绍 产品优势： ①  种类齐全，有完善的供应商体系，可覆盖各种动物种属； ②  有实验动物中心，具备大小动物实验动物使用许可证，SPF级屏障环境及普通环境； ③ 有经验丰富的实验动物专家，可定制化采集客户所需空白基质； ④  完善的质量控制系统，产品质量稳定，产量充足，溯源性好。 混合供体空白基质产品列表 参考资料： 1. 《中国药典》2020年版，9012生物样品定量分析方法验证指导原则。 2. BIOANALYTICAL METHOD VALIDATION M10，ICH，2019。 3.   Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry，FDA，2018。 4.    Guideline on bioanalytical method validation，EMA，2011。  IPHASE/汇智和源凭借多年的研发经验，推出了多领域、多种类的高端科研试剂，为药物早期研发提供筛选工具，为生命科学领域的探索提供新材料、新方法和新手段，为食品、药品、化学品等的遗传毒性研究提供便捷产品。 关    于    我    们 汇智和源，致力于为创新药研发企业及生命科学研究机构提供高品质的生物试剂，IPHASE为公司核心品牌，品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。 购买方式： 电话：400-127-6686 微信：直接扫描右侧微信二维码添加购买

专属血浆，为血浆蛋白结合试验“保驾护航” 2022-06-13

1    药物与血浆蛋白结合 药物和血浆蛋白的结合对药物在体内的分布和转运有重要影响，因此药物蛋白结合率的测定是新药开发过程中的一项重要工作。药物与血浆蛋白结合后很难通过血管壁，故蛋白结合型药物通常没有药理活性。相反，非结合的游离型药物易于透过细胞膜，与药物代谢、排泄以及药效密切相关，具有重要的临床意义。 血浆中与药物结合的蛋白主要有白蛋白（Albumin，65KDa）、脂蛋白（Lipoprotein，200~3400 KDa）、a1-酸性糖蛋白（Alpha acid glucoprotein，44KDa）。白蛋白是血浆中含量最高的蛋白，占血浆蛋白总量的60%，是主要的药物结合蛋白，华法林即是与白蛋白结合的典型代表。 2    血浆在蛋白结合试验中的重要性 药物与血浆蛋白的结合不但受药物理化性质、药物与蛋白质的亲和力、药物相互作用等影响，而且还与血浆息息相关，且血浆往往是试验成败的关键因素。然而，血浆的特性常与以下因素有关： ①  动物种属差异。不同种属动物的血浆对药物的亲和性不同，故造成药物蛋白结合率差异较大。 ②  性别差异。同一种属雌雄动物血浆药物结合蛋白的浓度存在差异，可能会影响到蛋白结合率。如女性体内白蛋白的浓度高于男性，故水杨酸的蛋白结合率女性高于男性。 ③  生理和病理状态。血浆容量及其组成随年龄而改变，故年龄是影响蛋白结合的一个重要因素；机体发生病变时，蛋白结合率也可能发生变化。如新生儿的血浆白蛋白比成人低，药物蛋白结合率亦较低，血浆中游离型药物的浓度相对较高，对药物的敏感程度也较成人高；肾功能不全时，血浆中蛋白含量降低，导致蛋白结合率下降。 因此，稳定、可靠的血浆供应是确保血浆蛋白结合试验顺利进行的保障。 3    IPHASE产品优势 IPHASE/汇智和源根据血浆蛋白结合试验的需求，筛选出了符合试验要求的专属血浆，为试验的顺利进行提供了保障。 l  多种属 本公司可提供猴、犬、大鼠、小鼠等种属不同抗凝剂的血浆，满足客户需求。 l  特定方式 试剂盒各成分均经过严格的质量检测，实验结果准确、可靠、重现性高。 l  安全性 采集血浆的动物均经过传染源的检测，使用更安全、放心。 l  溯源性 本公司血浆产品均可提供溯源性证明，为客户免除了后顾之忧。 l  质控数据齐全 本公司使用华法林的蛋白结合率指标作为该实验血浆合格与否的评估标准，所提供血浆的蛋白结合率均符合试验要求（见表1），为试验的成败多加了一个重要保障。 表1 华法林在不同种属血浆中的蛋白结合率 l  可定制 除常规种属血浆外，本公司还可根据客户需求，提供特殊种属血浆的定制服务。 4    相关产品 IPHASE/汇智和源凭借多年的研发经验，推出了多领域、多种类的高端科研试剂，为药物早期研发提供筛选工具，为生命科学领域的探索提供新材料、新方法和新手段，为食品、药品、化学品等的遗传毒性研究提供便捷产品。 关    于    我    们 汇智和源，致力于为创新药研发企业及生命科学研究机构提供高品质的生物试剂，IPHASE为公司核心品牌，品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。 购买方式： 电话：400-127-6686 微信：直接扫描右侧微信二维码添加购买

悬浮肝细胞、贴壁肝细胞相关产品 2022-06-10

贴壁肝细胞（人，猴，犬，SD大鼠，ICR/CD-1小鼠、兔、猪） 悬浮肝细胞（人，猴，犬，SD大鼠，ICR/CD-1小鼠、兔、猪）   IPHASE/汇智和源可提供悬浮原代肝细胞或贴壁原代肝细胞，包括人，食蟹猴，比格犬，SD大鼠，ICR/CD-1小鼠、小型猪、兔等，单供体或多供体混合，应用领域包括肝细胞代谢稳定性、CYP抑制试验、CYP诱导试验、肝细胞毒性试验等。   085A11.21 悬浮人肝细胞 IPHASE Suspension Human Hepatocytes,Male  085A12.21 贴壁人肝细胞 IPHASE Plateable Human Hepatocytes,Male 085A11.22 悬浮人肝细胞 IPHASE Suspension Human Hepatocytes,Female 085A12.22 贴壁人肝细胞 IPHASE Plateable Human Hepatocytes,Female 085A11.23 悬浮人肝细胞 IPHASE Suspension Human Hepatocytes 085A12.23 贴壁人肝细胞 IPHASE Plateable Human Hepatocyte 085B11.21 悬浮食蟹猴肝细胞 IPHASE Suspension Monkey(Cynomolgus) Hepatocytes,Male  085B12.21 贴壁食蟹猴肝细胞 IPHASE Plateable Monkey(Cynomolgus) Hepatocytes,Male 085B11.22 悬浮食蟹猴肝细胞 IPHASE Suspension Monkey(Cynomolgus) Hepatocytes,Female 085B12.22 贴壁食蟹猴肝细胞 IPHASE Plateable Monkey(Cynomolgus) Hepatocytes,Female 085B11.23 悬浮食蟹猴肝细胞 IPHASE Suspension Monkey(Cynomolgus) Hepatocytes 085B12.23 贴壁食蟹猴肝细胞 IPHASE Plateable Monkey(Cynomolgus) Hepatocyte 085B21.21 悬浮恒河猴肝细胞 IPHASE Suspension Monkey(Rhesus) Hepatocytes,Male  085B22.21 贴壁恒河猴肝细胞 IPHASE Plateable Monkey(Rhesus) Hepatocytes,Male 085B21.22 悬浮恒河猴肝细胞 IPHASE Suspension Monkey(Rhesus) Hepatocytes,Female 085B22.22 贴壁恒河猴肝细胞 IPHASE Plateable Monkey(Rhesus) Hepatocytes,Female 085B21.23 悬浮恒河猴肝细胞 IPHASE Suspension Monkey(Rhesus) Hepatocytes 085B22.23 贴壁恒河猴肝细胞 IPHASE Plateable Monkey(Rhesus) Hepatocyte 085C11.21 悬浮比格犬肝细胞 IPHASE Suspension Dog(Beagle) Hepatocytes,Male 085C12.21 贴壁比格犬肝细胞 IPHASE Plateable Dog(Beagle)Hepatocytes,Male 085C11.22 悬浮比格犬肝细胞 IPHASE Suspension Dog(Beagle) Hepatocytes,Female 085C12.22 贴壁比格犬肝细胞 IPHASE Plateable Dog(Beagle)Hepatocytes,Female 085C11.23 悬浮比格犬肝细胞 IPHASE Suspension Dog(Beagle) Hepatocytes 085C12.23 贴壁比格犬肝细胞 IPHASE Plateable Dog(Beagle)Hepatocytes 085D11.21 悬浮SD大鼠肝细胞 IPHASE Suspension Rat(Sprague Dawley) Hepatocytes,Male  085D12.21 贴壁SD大鼠肝细胞 IPHASE Plateable Rat(Sprague Dawley)Hepatocytes,Male 085D11.22 悬浮SD大鼠肝细胞 IPHASE Suspension Rat(Sprague Dawley) Hepatocytes,Female 085D12.22 贴壁SD大鼠肝细胞 IPHASE Plateable Rat(Sprague Dawley)Hepatocytes,Female 085D11.23 悬浮SD大鼠肝细胞 IPHASE Suspension Rat(Sprague Dawley) Hepatocytes 085D12.23 贴壁SD大鼠肝细胞 IPHASE Plateable Rat(Sprague Dawley)Hepatocytes 085E11.21 悬浮ICR/CD-1小鼠肝细胞 IPHASE Suspension Mouse(ICR/CD1) Hepatocytes ,Male 085E12.21 贴壁ICR/CD-1小鼠肝细胞 IPHASE Plateable Mouse(ICR/CD1) Hepatocytes,Male 085E11.22 悬浮ICR/CD-1小鼠肝细胞 IPHASE Suspension Mouse(ICR/CD1) Hepatocytes ,Female 085E12.22 贴壁ICR/CD-1小鼠肝细胞 IPHASE Plateable Mouse(ICR/CD1) Hepatocytes,Female 085E11.23 悬浮ICR/CD-1小鼠肝细胞 IPHASE Suspension Mouse(ICR/CD1) Hepatocytes 085E12.23 贴壁ICR/CD-1小鼠肝细胞 IPHASE Plateable Mouse(ICR/CD1) Hepatocytes   配套产品： 悬浮肝细胞培养基-复苏培养基 贴壁肝细胞培养基-复苏培养基+维持培养基+铺板培养基 胶原包被板 相关产品： 微粒体（肝微粒体、肠微粒体、肾微粒体、肺微粒体等） S9（肝S9、肠S9、肾S9、肺S9等） 胞质液/细胞浆（肝胞质液、肠胞质液、肾胞质液、肺胞质液等） CYP450重组酶（CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4） UGT重组酶（UGT1A1、UGT1A3、UGT1A4、UGT1A6、UGT1A7、UGT1A8、UGT1A9、UGT1A10、UGT2B7、UGT2B15、UGT2B17） 转运体   购买方式： 电话：400-127-6686 微信：直接扫描右侧微信二维码添加购买

菌株——Ames试验的“剖析者” 2022-05-31

1    Ames试验简介 Ames试验，亦称细菌回复突变试验（Bacterial Reverse Mutation Test)，于1975年由美国加利福尼亚大学伯克利分校生化系B.N.Ames教授实验室建立并不断发展完善，至今已成为国际上通用的遗传毒理评价体系的必检项目，同时也是许多遗传毒理学新兴技术发展过程中对照验证结果的试验之一，广泛应用于化合物的致突变性和潜在致癌性的初筛检验。当前，Ames试验在食品、药品、化学品、化妆品、农药、医疗器械等多个领域中得到了广泛的应用，成为产品研发和申报阶段必须开展的遗传毒性试验。 Ames试验是利用鼠伤寒沙门氏菌或大肠杆菌营养缺陷型菌株与被检测化合物共培养，如果化合物有一定的致突变性，则可使缺陷型菌株发生回复突变，重新突变为野生型。野生型菌株自身能合成组氨酸/色氨酸，能在无组氨酸/色氨酸的培养基上生长并形成菌落，营养缺陷型菌株自身不能合成组氨酸/色氨酸，不能在无组氨酸/色氨酸的培养基上形成菌落，据此可评价受试物的致突变性。 2    Ames试验菌株 Ames试验是以营养缺陷型的突变体菌株为指示生物检测基因突变的体外试验，常用的菌株有组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌或色氨酸缺陷型大肠杆菌。 2.1 菌株基因型和突变类型 2.2 不同研究领域的Ames试验的菌株组合 表1 不同研究领域的Ames试验的菌株组合比较 3    IPHASE Ames试验产品 IPHASE/汇智和源以各领域细菌回复突变试验的国家标准和指导原则为技术资料，整合了各标准中诱导S9制备方法、Ames试验菌株组合、标准诱变剂选择和相关试剂的浓度要求等技术要素，在不断的试验和优化过程中形成了遗传毒性Ames试剂盒及相关产品，助力于食品、药品、化妆品、化学品、医疗器械和农药等的致突变作用的研究。 4    IPHASE产品优势 l  便捷 省去诱导S9制备、试剂配制和菌悬液制备的时间，可以直接使用，大大缩短了实验周期。 l  准确 试剂盒各成分均经过严格的质量检测，实验结果准确、可靠、重现性高。 l  应用广 应用范围广，可用于食品、药品、化妆品、化学品、医疗器械、农药等的遗传毒性研究。 l 定制服务 可根据客户需求提供定制产品。 IPHASE/汇智和源凭借多年的研发经验，推出了多领域、多种类的高端科研试剂，为药物早期研发提供筛选工具，为生命科学领域的探索提供新材料、新方法和新手段，为食品、药品、化学品等的遗传毒性研究提供便捷产品。 5    相关产品 关    于    我    们 汇智和源，致力于为创新药研发企业及生命科学研究机构提供高品质的生物试剂，IPHASE为公司核心品牌，品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。 购买方式： 电话：400-127-6686 微信：直接扫描右侧微信二维码添加购买

空白全血，空白外周血——空白生物基质 2022-05-27

在生物样品分析过程中，如采用质谱方法进行试验时，需要考察基质效应。在考察基质效应的过程中，需使用至少6批来自不同供体的空白基质。我们可根据客户需求提供混合或单供体的空白基质。 IPHASE/汇智和源可提供不同动物种属空白全血、血浆、血清，包括大鼠全血，小鼠全血，比格犬全血，猴全血，兔全血，猪全血等，另外还可提供特殊动物种属空白基质定制采集服务。 产品： 空白大鼠全血    Rat Whole Blood  SD大鼠，Wistar大鼠 空白小鼠全血    Mouse Whole Blood  ICR/CD-1小鼠，C57小鼠，BALB/c小鼠 空白比格犬全血  Beagle Dog Whole Blood 空白猴全血      Monkey Whole Blood  食蟹猴 恒河猴 空白兔全血      Rabbit Whole Blood  新西兰兔 空白猪全血      Minipig Whole Blood 巴马小型猪 其他全血定制 空白基质： 全血，血清，血浆，脑脊液，乳汁，尿液，胆汁，胃液，粪便，肝组织，脑组织，肾组织，肺组织，卵巢组织，角膜组织，房水，玻璃体液，组织匀浆液等。 动物种属：  食蟹猴，恒河猴，比格犬，SD大鼠，Wistar大鼠，Wistar Han大鼠，ICR/CD-1小鼠，C57小鼠，BALB/c小鼠，金黄地鼠，豚鼠，小型猪，兔，猫，牛，羊等。  购买方式： 电话：400-127-6686 微信：直接扫描右侧微信二维码添加购买