体外哺乳类细胞微核试验原理及注意​事项 2021-10-15

微核试验是遗传毒性研究标准组合试验之一，在食品，化学品，药品，农药，饮用水等多类产品的遗传毒性评价方面得到广泛应用。与体内实验相比，体外微核试验更加简单快速，避免动物个体差异影响，灵敏度高。体外微核试验主要包括体外哺乳类细胞微核试验，人外周血淋巴细胞微核试验，肝原代细胞微核试验等类别。 体外哺乳类细胞微核试验是一种用于检测哺乳类细胞在受试物处理后是否产生微核的遗传毒性检测方法。该试验适用于检测有丝分裂细胞暴露于受试物期间或之后致染色体断裂和诱发非整倍体的能力。如果 3 h～6 h 短期处理的试验结果为阴性或不确定时，需要进行无代谢活化系统的长期处理试验，相当于用受试物处理细胞 1.5 个～2.0 个正常细胞周期。 参考导则： GB 15193.28 - 2020 食品安全国家标准 体外哺乳类细胞微核试验 一、仪器、试剂 1.1 仪器 细胞培养箱、倒置显微镜、正置显微镜、超净台、离心机。 1.2 代谢活化系统 1.2.1 S9 辅助因子的配制 1.2.1.1 镁钾溶液 氯化镁 1.9 g 和氯化钾 6.15 g 加蒸馏水溶解至 100 ml。 1.2.1.2 0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液 (pH 7.4) 磷酸氢二钠 (Na2 HPO4，28.4 g/L)440 mL, 磷酸二氢钠 (NaH2PO4·H2O,27.6 g/L)60 mL，调 pH 至 7.4，0.103 MPa 20 min 灭菌或滤菌。 1.2.1.3 辅酶-Ⅱ(氧化型) 溶液 无菌条件下称取辅酶-Ⅱ，用无菌蒸馏水溶解配制成 0.025mol/L 溶液，现用现配。 1.2.1.4 葡萄糖- 6 -磷酸钠盐溶液 称取葡萄糖- 6 磷酸钠盐, 用蒸馏水溶解配制成 0.05 mol/L 溶液，过滤灭菌。现用现配。 1.2.2 大鼠肝 S9 组分的诱导和配制 选健康雄性成年 SD 或 Wistar 大鼠，体重 150 g～200 g，约 5 周龄～6 周龄。将多氯-联-苯 (Aroclor 1254) 溶于玉米油中，浓度为 200 g/L，按 500 mg/kg 体重无菌操作一次腹腔注射，5 d 后处死动物，处死前禁食 12 h。 也可采用苯巴比-妥-钠和β-萘黄酮联合诱导的方法进行制备，经口灌胃给予大鼠苯巴比-妥-钠和β-萘黄酮，剂量均为 80 mg/kg 体重，连续 3d，禁食 16 h 后断头处死动物。其他操作同多氯联苯诱导。 S9 组分制成后，经无菌检查，测定蛋白含量 (Lowry 法)，每毫升蛋白含量不超过 40 mg 为宜，并经间接致突变剂鉴定其生物活性合格后贮存于- 80°C 低温或冰冻干燥，保存期不超过 1 年。 1.2.3 S9 混合液的制备 S9 混合液浓度一般为 1%～10%，实际使用浓度可由各实验室决定，但需对其活性进行鉴定，必须能明显活化阳性对照物，且对细胞无明显毒性。 一般由 S9 组分和辅助因子按 1:9 组成 10% 的 S9 混合液，无菌现用现配。10%S9 混合液 10 mL 配制方法如下: 取上述磷酸盐缓冲液 6.0 mL、镁钾溶液 0.4 mL、葡萄糖- 6 -磷酸钠盐溶液 1.0 mL、辅酶 II 溶液 1.6 mL、肝 S9 组分 1.0 mL，混匀，置冰浴中待用。 1.3 肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素 B(CytochalasinB，cytoB) 溶液 用二甲基亚砜 ( DMSO) 配制适当浓度的储备液，避光冷藏保存。cytoB 的终浓度通常为 3 μg/ mL ～6 μg/mL，实验室应根据各种细胞系选择 cytoB 的适当终浓度，以达到理想的双核细胞出现频率。 1.4 0.075 mol/L 氯化钾溶液 5.59 g 氯化钾加蒸馏水至 1000 ml。 1.5 固定液 甲醇: 冰醋酸为 3:1，临用前配制。 1.6 姬姆萨 (Giemsa) 染液 取姬姆萨染料 3.8 g ，置乳钵中，加少量甲醇研磨。逐渐加甲醇至 375 mL，待完全溶解后，再加 125 mL 甘油，放入 37° C 温箱中保温 48 h。保温期间振摇数次，使充分溶解。取出过滤，2 周后使用，作为姬姆萨染液原液。使用时, 取 1 份姬姆萨染液原液，与 9 份 1 / 15 mol/L 磷酸盐缓冲液 (pH 6.8) 混合, 配成其应用液. 现配现用。 磷酸盐缓冲液 (1 / 15 mol/L，pH 6.8) 配制方法如下： a) 第一液：取磷酸氢二钠 (Na2 HPO4)9.47 g 溶于 1000 mL 去离子水中，配成 1 / 15 mol/L 溶液； b) 第二液：取磷酸二氢钾 (KH2 PO4 )9.07 g 溶于 1 000 mL 去离子水中，配成 1 / 15 mol/L 溶液； c) 取第一液 50 mL 加于第二液 50 ml 中混匀，即为 pH 6.8 的 1 / 15 mol/L 磷酸盐缓冲液。 二、 试验方法 2.1 受试物 固体受试物应溶解于适合的溶媒中，并稀释至适当浓度。液体受试物可直接使用或稀释至适当浓度使用。受试物应无菌现用现配，否则须确认储存不影响其稳定性。 2.2 细胞 可选用中国仓鼠肺细胞株 (V79、CHL) 或卵巢细胞株 (CHO)、小鼠淋巴瘤细胞株 (L5178Y)、人外周血淋巴细胞株 (如 TK6) 和原代培养细胞。推荐使用 CHL 或 L5178Y 细胞株。细胞在使用前应进行染色体数目稳定性和有无支原体污染的检查。汇智泰康体外微核试验试剂盒推荐使用中国仓鼠肺细胞株（CHL）。 2.3 试验方案选择 试验分为使用和不使用 cytoB 两种方案。 方案一： 在细胞经过受试物处理，有丝分裂前使用 cytoB，然后观察分析已完成一次有丝分裂的细胞 (双核细胞) 微核率。当选用人类淋巴细胞时, 建议采用方案一，因为不同来源的细胞周期不同，而且不是所有的细胞都对植物血球凝集素 (PHA) 有反应。 方案二： 不使用 cytoB，细胞经过受试物处理后观察分析细胞微核率。如果有证据表明受试物干扰 cytoB 的活性，或 cytoB 可能影响细胞的生长 (如小鼠淋巴瘤细胞株)，建议采用方案二。 2.4 剂量 2.4.1 剂量设置 至少应设置 3 个检测剂量。受试物没有细胞毒性时，从最高剂量往下设至少 2 个剂量，一般情况下间隔系数可为 2～3；有细胞毒性时，其剂量范围应涵盖从 55% 士 5% 的细胞毒性到几乎无细胞毒性。 2.4.2 最高剂量的选择 决定最高剂量的因素是细胞毒性、受试物的溶解度以及 pH、渗透压。 受试物有细胞毒性时，最高剂量应能引起 55% 士 5% 的细胞毒性；如果没有细胞毒性或沉淀，最高剂量应是 5 μL/mL、5 mg/ml 或 10 mmol/L。 对溶解度较低的物质. 当达到最大溶解浓度时仍无毒性，则最高剂量应是在最终培养液中溶解度限值以上的一个浓度。在某些情况下，应使用一个以上可见沉淀的浓度，溶解性可用肉眼鉴别，但沉淀不能影响观察。 2.4.3 细胞毒性的确定， 在 S9 存在和不存在两种条件下依据细胞完整性和生长情况的指标来确定细胞毒性。 2.4.4 阳性对照 阳性对照物包括染色体断裂剂和非整倍体剂。加 S9 时，断裂剂可以选用环磷酰胺和苯并 (a) 芘；不加 S9 时，断裂剂可以选用阿糖胞苷、丝裂霉素 C、甲磺酸甲酯和 4 -硝基喹啉；非整倍体剂只用于不加 S9 时，可以选用秋水仙素和长春新碱。 如果短期处理试验方案在 S9 存在和不存在两种条件下都选用断裂剂作为阳性对照，那么长期处理试验方案应该选用非整倍体剂作为阳性对照。如果选用的细胞本身具有代谢能力，则不需要另外添加 S9，阳性对照应该同时使用断裂剂和非整倍体剂。 2.4.5 阴性对照 溶媒必须是非致突变物，不与受试物发生化学反应，不影响组胞存活和 S9 活性。首选溶媒是培养液 (不含血清) 或水。使用水作为溶媒时其体积不应大于总体积的 10%。DMSO 也是常用溶媒，但终浓度不应大于 1%。 2.4.6 空白对照 如果没有文献资料或历史资料证实所用溶媒无致突变作用时应设空白对照。 2.5 试验步骤 2.5.1 细胞准备 将一定数量的细胞接种于培养皿 (瓶) 中，以收获细胞时，培养皿 (瓶) 的细胞未长满为标准，贴壁细胞一般以长到 85% 左右为佳。 2.5.2 受试物处理 2.5.2.1 应用方案一，吸去培养液，用磷酸盐缓冲液洗细胞，加入无血清培养液及一定浓度的受试物 (需代谢活化者同时加人 S9 mix)，置于培养箱中 3 h～6 h；结束后吸去含受试物的培养液，用 PBS 洗细胞，加人含 10% 血清的新鲜培养液和 cytoB，继续培养 1.5 个～2.0 个正常细胞周期后收集细胞。 对于淋巴细胞，最有效的方法是在有丝分裂原 (如 PHA) 刺激后 44 h～48 h 开始受试物处理，这时细胞开始进入分裂周期。 如果 3 h～6 h 短期处理的试验结果为阴性或不明确时，需要进行无 S9 的长期处理试验，用 cytoB 和受试物处理细胞 1.5 个～2.0 个正常细胞周期，在处理结束后收集细胞。 如果已知或怀疑受试物 (如核苷类物质) 可能影响细胞周期 (特别是 P53 活性细胞)，则细胞收获时间应该再延长 1.5 个～2.0 个正常细胞周期。 2.5.2.2 应用方案二，与 2.5.2.1 处理方法相同，只是不加 cytoB。 2.5.3 收获细胞与制片 每次培养都应单独收获细胞和制片，如果细胞混合液的分散度良好则不需要进行低渗处理。 2.5.3.1 消化 贴壁细胞用 0.25% 胰蛋白酶溶液消化，待细胞脱落后，加入含 10% 胎牛或小牛血清的培养液终止胰蛋白酶的作用，混匀，放人离心管以 800r/min～1 000r/min 的速度离心 5 min，弃去上清液。悬浮细胞不需要消化，直接离心。. 2.5.3.2 低渗 加入 0.075 mol/L 氯化钾溶液 2 mL，用滴管将细胞轻轻地混匀，放人 37°C 细胞培养箱中低渗处理 1 min～5 min. 2.5.3.3 固定 加入 2 mL 固定液，混匀后固定 5 min 以上，以 800 r/min～1 000 r/min 的速度离心 5 min，弃去上清液。重复一次，弃去上清液。 2.5.3.4 滴片 加人数滴新鲜固定液，混匀。用混悬液滴片，自然干燥。 2.5.3.5 染色 推荐用姬姆萨染色 (5% ～10% 姬姆萨染液，15 min～ 20 min),，也可用 DNA 特异性荧光染料 (如: 吖啶橙或 Hoechst 33258)。 如果需要区分染色体断裂剂和非整倍体诱变剂，可用荧光原位杂交 (FISH) 或引物原位标记等方法。 2.5.4 阅片 2.5.4.1 微核的判断标准：微核一般为圆形或椭圆形，直径不超过主核的 1 / 3；与主核在一个焦点平面上，与主核的颜色、结构特征及折光性一致；与主核之间没有核物质相连，可以和主核有边界的重叠，但能看清各自的核膜。 2.5.4.2 应用方案一，每个剂量组至少分析 2000 个双核细胞，计算微核细胞率 (一个双核细胞不论含有几个微核，都只算作一个含微核细胞)。如果单次培养可供计数的双核细胞数少于 2000，则应采用多次细胞培养或平行培养。对不规则的双核细胞 (如两个核大小相差悬殊) 和多于两个核的细胞不进行分析。 2.5.4.3 应用方案二，每个剂量组至少分析 2 000 个细胞，计算微核细胞率。如果单次培养可供计数的细胞数少于 2000，则应采用多次细胞培养或平行培养。 三、数据处理和结果判定 3.1 数据处理 数据按不同剂量列表，指标包括细胞毒性、观察细胞数、含微核细胞数及微核细胞率。受试物各剂量组与空白对照组、阴性对照组 (溶媒对照组)、阳性对照组的微核细胞率用适当的统计学方法 (如 X2 检验) 进行处理。 3.2 结果判定 下列两种情况可判定受试物在本试验系统中为阳性结果； a) 受试物引起微核细胞率的增加具有统计学意义，并与剂量相关; b) 受试物在任何一个剂量条件下，引起的微核细胞率增加具有统计学意义，并有可重复性。 四、试验解释 阳性结果表明受试物在该试验条件下可引起所用哺乳类细胞染色体损伤，微核细胞率增加。阴性结果表明在该试验条件下受试物不引起所用哺乳类细胞染色体损伤。评价时应综合考虑生物学和统计学意义。 体外微核试验试剂盒 北京汇智泰康针对体外哺乳类细胞微核试验开发体外微核试验试剂盒，本试剂盒提供了进行体外哺乳类细胞微核试验所需的主要试剂和细胞，快速检测受试物是否有导致染色体断裂和诱发非整倍体的情况，从而评价受试物的遗传毒性，试剂盒的使用可以大大节约实验人员的准备时间。 【产品使用说明】 1、细胞复苏 收到试剂盒后，请尽快复苏细胞。 从- 70 冰箱取出细胞，于 37℃ 水浴融化，离心，弃上清，用含 10% 牛血清 RPMI 1640 培养液（RPMI- 10）中重悬细胞后，再次离心；弃上清，用 RPMI- 10 重悬后接种于细胞培养瓶，于 37℃ 二氧化碳培养箱中培养，后期细胞传代比例为 1:3。 2、细胞准备 将处于对数生长期，贴壁生长良好的细胞用胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）消化处理制成细胞悬液，5 mL/瓶接种于 25 cm2 细胞培养瓶中，于 37℃、5% 二氧化碳培养箱中加湿培养约 24 h- 48 h。 3、染毒处理 吸去培养瓶中培养液，加入一定浓度的受试物、S9 混合液（不加 S9 混合液时，需用培养液补足）以及一定量不含血清的培养液，于培养箱中处理 3 h。弃去处理液，使用 PBS 洗涤细胞 2～3 次，换液后，按 1% 的比列加入细胞松弛素 B（如 4.95 mL RPMI- 10 + 0.05 mL cytoB）。具体试验方案见下表： 4、收获细胞及制片 用胰蛋白酶溶液消化细胞，加入 0.075mol/L 氯化钾溶液进行低渗处理，固定液（甲醇：冰醋酸 = 3：1，可适当调整冰醋酸浓度，但不宜过大）进行固定并滴片，用吉姆萨染液染色，中性树胶封片，并于油镜下进行阅片，每处理组计数 500 个细胞中的增值指数 CBPI 和细胞复制指数 RI，计算出细胞毒性；每一剂量组应分析不少于 2000 个核型相差不大的双核细胞，计算微核率。 【注意事项】 实验前请自行准备 RPMI 1640 培养液、牛血清、细胞培养瓶、0.075mol/L 氯化钾溶液、甲醇、冰醋酸、吉姆萨染液、胰蛋白酶、24 孔细胞培养板、灭菌枪头、无菌移液管、二氧化碳培养箱、振荡器、15、50 mL 离心管等，所有耗材需做无菌处理。

体外哺乳类细胞HGPRT基因突变试验原理及注意事项 2021-10-15

体外哺乳类细胞基因突变（HGPRT）试验原理及注意事项  In vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test 【试验原理】 体外哺乳动物细胞基因突变试验是利用培养的哺乳动物细胞作指示生物的体外遗传毒理学试验，可用于检测有化学物质诱导的基因突变，适用的细胞系包括小鼠淋巴瘤细胞（L5178Y），中国仓鼠肺细胞（V79），中国仓鼠卵巢细胞（CHO），人类淋巴母细胞（TK6）等。这些细胞系，常用的遗传学终点是检测胸苷激酶（TK）图标，次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶（HPRT/HGPRT）图标，黄嘌呤转磷酸核糖激酶（XPRT）基因突变。TK、HPRT/HGPRT、XPRT突变试验可以检测不同的遗传事件谱。 细胞在正常情况下，能产生HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶），在含有6-硫代鸟嘌呤（6-thioguanine,6-TG）的选择性培养液中，HGPRT催化产生核苷-5，-单磷酸（NMP），NMP掺入DNA中致细胞死亡。在致癌和（或）致突变物作用下，某些细胞X染色体上控制HGPRT的结构基因发生突变，不能再产生HGPRT， 从而使突变细胞对6-TG具有抗性作用，能够在含有6-TG的选择性培养液中存活生长。在有或无代谢活化系统的条件下，将细胞培养物暴露于受试物中适当时间，然后将细胞再传代培养，在含有6-TG的选择性培养液中，突变细胞会继续分裂并形成集落，计数突变集落形成数，计算突变频率，从而推断受试物的致突变性。 【参考标准】 GB 15193.12-2014 体外哺乳类细胞HGPRT基因突变试验 【材料和试剂】 细胞：常用中国仓鼠肺细胞株（V79）和中国仓鼠卵巢细胞株（CHO），其他如小鼠淋巴瘤细胞株（L5178Y）和人类淋巴母细胞株（TK6）亦可。细胞在使用前应进行有无支原体污染的检查。 培养液：应根据试验所用系统和细胞类型来选择适宜的培养基。对于 V79和 CHO 细胞，常用最-低必需培养基（MEM，Eagle）、改良 Eagle培养基（DMEM）加人10%胎牛血清和适量抗菌素。对于 TK6 和 L5178Y细胞，常用 RPMI 1640培养液，加人10%马血清（培养瓶培养）或20%马血清（96孔板培养）和适量抗菌素（青霉素、链霉素）。 胰蛋白酶/EDTA溶液：用无钙、镁 PBS配制，胰酶的浓度为0.05 %，EDTA 的浓度为0.02% ,胰蛋白酶与EDTA溶液按1:1混合。-20℃储存。 活化系统：通常使用的是S9混合物。 选择剂：6-硫代鸟嘌呤(6-TG)，建议使用终浓度为5μg/mL～15μg/mL,用碳酸氢钠溶液(0.5 %)配制。 预处理培养液(THMG/THG)：为减少细胞的自发突变频率，在试验前，先将细胞加在含 THMG的培养液中培养24h，清除自发的突变细胞，然后再将细胞接种于THG(不含氨甲喋呤的THMG培养液)中培养1d～3d至细胞恢复正常生长周期和形态。 THMG 所含各物质终浓度如下(除培养液成分外): ————胸苷，5×10-6 mol/L； ————次黄嘌呤，5×10-5 mol/L； ————氨甲喋呤，4×10-7 mol/L； ————甘氨酸，1×10-4 mol/L； 【试验方法】 一、受试物 受试物配制：固体受试物应溶解或悬浮于适合的溶媒中，并稀释至适当浓度。液体受试物可直接使用或稀释至适当浓度。受试物应在使用前现用现配，否则就必须证实贮存不影响其稳定性。 溶媒的选择：溶媒必须是非致突变物，不与受试物发生化学反应，不影响细胞存活和S9活性。首-选溶媒是蒸馏水；对于不溶于水的受试物可选择其他溶媒，首-选二甲基亚矾(DMSO)，但使用时浓度不应大于0.5%。 对照： 每一项试验中，在有无代谢活化系统条件下均应设阳性和阴性(溶媒)对照组。 阳性对照：当使用代谢活化系统时,阳性对照物必须是要求代谢活化、并能引起突变的物质，可以使用3-甲基胆蒽(3-methylcholanthrene)、N-亚硝基二甲-胺(N-nitroso-dimethylamine)、7,12-二甲基苯并[a]蒽(7, 12-dimethylbenz[a]anthracene)等。在没有代谢活化系统时,阳性对照物可使用甲磺酸乙酯(ethyl methanesulphonate)、乙基亚-硝基-脲(ethylnitrosourea)等。也可使用其他适宜的阳性对照物。 阴性对照：阴性对照(包括溶媒对照)除不含受试物外，其他处理应与受试物相同。此外，当不具有实验室历史资料证实所用溶媒无致突变作用和无其他有害作用时，还应设空白对照。 二、剂量 最-高浓度选择：决定最-高浓度的因素是细胞毒性、受试物在试验系统中的溶解度以及pH 或渗透压的改变。 细胞毒性确定：应使用指示细胞完整性和生长情况的指标，在代谢活化系统存在和不存在两种条件下确定细胞毒性，例如相对集落形成率或相对存活率。应在预试验中确定细胞毒性和溶解度。 浓度设置和最-高浓度选择：至少应设置4个可供分析的浓度。当有细胞毒性时，其浓度范围应包括从最大毒性至几乎无毒性，通常浓度间隔系数在2～√10之间；如最-高浓度是基于细胞毒性，那么该浓度组的细胞相对集落形成率或相对存活率应为 10%～20 %(不低于10% )。对于那些细胞毒性很低的化合物，最-高浓度应是5μL/mL、5mg/mL或0.01mol/L。对于相对不溶解的物质，其最-高浓度应达到或超过在细胞培养状态下的溶解度限值；最-好在试验处理开始和结束时均评价溶解度，因为由于S9等的存在，试验系统内在暴露过程中溶解度可能发生变化，不溶解性可用肉眼鉴别，但沉淀不应影响观察。 三、试验步骤和观察指标 贴壁生长细胞的试验步骤和观察指标： 细胞准备：将5×105 个细胞接种于直径为10 mm平皿中，于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养24h。 接触受试物：吸去培养液，PBS洗两次，加人一定量的无血清培养液、一定浓度的受试物及S9混合物(无需代谢活化者用无血清培养液补足），置于培养箱中3h～6h，结束后吸去含受试物的培养液，用 PBS洗细胞两次，换入含10%血清的培养液，继续培养19h～22 h。 表达：接触受试物的细胞继续培养19h～22 h后用胰酶-EDTA 消化，待细胞脱落后，加入含10%血清的培养液终止消化，混匀，放入离心管以800r/min～1000r/min的速度离心5min～7min，弃上清液，制成细胞悬液，计数，以5×105 个细胞接种于直径为10 mm 的平皿，3d后传代，仍接种5×105个细胞培养3d（最-佳表达时间为6d～8d）。 细胞毒性测定：将上述首次消化计数后的细胞每皿接种200个，每组5个皿，37℃、5二氧化碳条件下培养7d，固定，Giemsa染色，计数每皿集落数。 突变体的选择及集落形成率的测定：表达结束后，消化细胞，分种，每组5个皿，每皿接种200个细胞，不加6-TG，7d后固定，Giemsa染色，统计每皿集落数，计算集落形成率。同时另做突变频率测定，每组5个皿，每皿接种2×105个细胞，待细胞贴壁后加人6-TG（建议使用终浓度为5μg/mL～10μg/mL），放人培养箱培养8d～10d后固定，Giemsa染色，统计每皿集落数，并计算突变频率。 悬浮生长细胞的试验步骤和观察指标： 细胞准备及接触受试物：取生长良好的细胞，调整密度为5×105/mL，按1%体积加入一定浓度的受试物及S9混合物（无需代谢活化者用无血清培养液补足），37 ℃振摇处理3h～6h，以800r/min～1000r/min的速度离心4min～6min，弃上清液，用PBS或无血清培养液洗细胞2次，重新悬浮细胞于含10%马血清的RPMI1640培养液中，并调整细胞密度为2×105/mL。 PE0（0天的平板接种效率）测定：取适量细胞悬液，作梯度稀释至8个细胞/mL，接种96孔板（每孔加0.2mL，即平均1.6个细胞/孔），每个剂量接种1～2块平板，37℃，5 二氧化碳，饱和湿度条件下培养9d～11d，计数每块平板有集落生长的孔数。 表达：取上一步所得细胞悬液，作6d表达培养，每天计数细胞密度并保持密度在1×106/mL以下。 PE6（第六天的平板接种效率）测定：表达培养结束后，取适量细胞悬液，按PE0（0天的平板接种效率）测定方法测定PE6。 突变频率（MF）测定：表达培养结束后，取适量细胞悬液，调整细胞密度为1×105/mL，加人6-TG（建议使用终浓度为5μg/mL～15μg/mL），混匀，接种96孔板（每孔加0.2mL，即2×104 个细胞/孔），每个剂量接种2～4块平板，37℃，5%二氧化碳，饱和湿度条件下培养11d～14d，计数有突变集落生长的孔数。 【数据处理和结果评价】 数据处理 贴壁生长细胞 HGPRT试验数据处理： 细胞毒性：以相对于溶媒对照组的集落形成率表示细胞毒性。即以溶媒对照的集落形成率为100%(1.00),求出各受试物组的相对值。   集落形成率和突变频率：   悬浮生长细胞 HGPRT试验数据处理： 平板接种效率(PE0、PE6)：   相对存活率（RS）：   突变频率（MF）：   结果评价： 阳性结果的判定： 受试物组在任何一个剂量条件下的突变频率为阴性（溶媒）对照组的3倍或3倍以上，可判定为阳性。 受试物组的突变频率增加，与阴性（溶媒）对照组比较具有统计学意义，并有剂量-反应趋势，则可判定为阳性。 受试物组在任何一个剂量条件下引起具有统计学意义的增加并有可重复性，则可判定为阳性。 阴性结果的判定： 不符合上述阳性结果判定标准，则可判定为阴性。 【试验报告】 试验名称、试验单位名称和联系-方式、报告编号。 试验委托单位名称和联系-方式、样品受理日期。 试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期。 试验摘要。 受试物：名称、鉴定资料、CAS编号（如已知）、纯度、与本试验有关的受试物的物理和化学性质及 稳定性等。 溶媒和载体：溶媒和载体的选择依据，受试物在溶媒和载体中的溶解性和稳定性。 细胞株：名称、来源、浓度及培养条件（包括培养基的组成、培养温度、CO2浓度和培养时间）。 试验条件：剂量、代谢活化系统、标准诱变剂、操作步骤等。 试验结果：各剂量组受试物（加和不加S9）对细胞的毒性和突变频率的均数和标准差、是否具有剂量-反应关系、统计结果，同时进行的阴性（溶媒）对照和阳性对照的均数和标准差、以及阴性（溶媒）对照和阳性对照的历史范围。 结论：本试验条件下受试物是否具有致突变作用。 【试验解释】 若阴性对照中，集落形成率或存活率低于50%，结果应不采用。各实验室选用的阳性对照突变频率有一定范围，若受试物的结果为阴性或弱阳性时，阳性对照的诱变率应达正常值的下限以上，否则结果不能成立。 HGPRT基因突变试剂盒 北京汇智泰康针对体外哺乳类细胞HGPRT基因突变试验开发HGPRT基因突变试剂盒，试剂盒提供了进行体外哺乳类细胞HGPRT基因突变试验所需的主要试剂和细胞(V79)，可用于评价受试物的致突变作用。所用细胞和试剂均符合国标GB 15193.12-2014 《食品安全-国家标准 体外哺乳类细胞HGPRT基因突变试验》的要求。 20mL×24体系/盒，4个剂量组。 【产品使用说明】 1、细胞复苏 收到试剂盒后，请尽快复苏细胞。 从-70℃冰箱中取出细胞，于37℃水浴融化，离心，弃上清，用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基重悬；再次离心，弃上清，用10% FBS培养基，接种于细胞培养瓶中，放置于37℃的二氧化碳培养箱中培养，后期细胞传代比例为1:3。 2、自发突变细胞清除 取对数生长期细胞悬液，于含1% （V/V）的THMG的培养液中培养24 h，离心，洗涤后将细胞接种于含1% （V/V）的THG（不含氨甲喋呤）培养液中继续培养1d~3d，至细胞恢复正常生长周期和形态。 注：为确保试验的可行性，试验中所用细胞的自发突变率应在5×10-6~20×10-6之间，清除自发突变的细胞传代使用不得超过1个月，且每次试验前需将细胞清除自发突变。 3、染毒处理 将5×105个细胞接种于直径为100mm的平皿中，于37℃，5%二氧化碳培养箱中放置培养24h。吸去培养液，PBS洗两次，加入一定量的无血清培养液、一定浓度的受试物及10%S9混合液（无需代谢活化者用无血清培养液或S9反应液PS补足），置于37℃，5%二氧化碳培养箱中培养3~6h，结束后吸去含受试物的培养液，用PBS洗细胞两次，换入含10%血清的培养液，继续培养19~22h，每个试验组平行处理两份培养物。 （1）S9混合液及染毒用细胞液配制 注：在试验过程中，需根据实际需求，调整配制量。 （2）推荐染毒培养体系配制方案（试剂盒仅提供1次完整实验的4个剂量组所需） 注：1.染毒时间可根据实际情况进行调整，一般为3h~6h，必要时可延长到1个或多个细胞周期。 2.如进行短时间染毒，可直接加入稀释并混合均匀的丝裂-霉素C；若进行24h染毒，则需将丝裂-霉素C再稀释2.5倍后再加入。 4、表达培养 接触受试物的细胞继续培养19~22h后，用胰酶-EDTA消化，待细胞脱落后，加入含10%血清的培养液终止消化，混匀，放入离心管中800r/min~1000r/min的速度离心5~7min，弃上清液，制成细胞悬液，计数，以5×105个接种于直径为100mm的平皿，3d后传代，仍接种5×105个细胞培养3d（最-佳表达时间为6d~8d）。 5、细胞毒性测定 将上述首次消化计数后的细胞每皿接种200个，每组5个皿，37℃、5%的二氧化碳条件下培养7d，固定，Giemsa染色，计数每皿集落数。 以相对于溶媒对照组的集落形成率表示细胞毒性，即以溶媒对照的集落形成率为100%，求出各受试物组的相对值。计算公式见（1）： A=B/C×100%------------------------------------------（1） 式中：A—相对集落形成率，%；B—受试物组集落形成率，%；C—溶媒对照组集落形成率，%。 6、突变体的选择和集落形成率的测定 表达培养结束后，消化细胞，分种，每组5个皿，每皿接种200个细胞，不加6-TG，7d后固定，Giemsa染色，统计每皿集落数，计算集落形成率。同时另做突变频率测定，每组5个皿，每皿接种2×105个细胞，待细胞贴壁后，按照千分之一的比例加入6-TG，放入培养箱中培养8~10d后固定，Giemsa染色，统计每皿集落数，计算突变频率。 集落形成率计算见式（2）： D=E/F×100%-------------------------------------------（2） 式中：D—集落形成率，%；E—实际存活的细胞集落数；F—接种细胞数。 突变频率计算见式（3）： 式中：G—突变频率；H—突变集落数；I—接种细胞数；D—集落形成率。 7、结果评价 7.1 实验成立条件 若阴性对照中，集落形成率低于50%，结果应不予采用。 若受试物的结果为阴性或弱阳性时，阳性对照的诱变率应达正常值的下线以上，否则结果不成立。 7.2 结果判定 受试物组在任何一个剂量下的突变频率为阴性（溶媒）对照组的3倍或3倍以上，可判定为阳性。 受试物组的突变频率增加，与阴性（溶媒）对照组比较具有统计学意义，并有剂量-反应趋势，则可判定为阳性。 受试物组在任何一个剂量条件下引起具有统计学意义的增加并有可重复性，则可判定为阳性。 不符合上述阳性结果判定标准，则可判定为阴性。 【注意事项】 实验前请自行准备胎牛血清、RPMI1640基础培养液、胰酶-EDTA、Giemsa染色液、100mm平皿、灭菌枪头、无菌移液管、二氧化碳培养箱、振荡器、50mL离心管等，所有耗材需做无菌处理。 购买方式： 电话：400-127-6686 微信：直接扫描右侧微信二维码添加购买

平衡透析法测定血浆蛋白结合率原理及装置 2021-10-15

药物血浆蛋白结合率（Plasma Protein Binding, PPB）即血液中与蛋白结合的药物占总药量的百分数，可以反映药物与血浆蛋白结合的程度。药物血浆蛋白结合率是药物在动物体内重要的药理学参数之一，影响着药物体内游离浓度进而影响药物的分布与排泄。药物在进入血液后与血浆蛋白会有不同程度结合，血液中游离药物的比例会影响其在体内吸收、分布、代谢和排泄的过程，与血浆蛋白结合的药物可能会有更长的半衰期和更慢的清除速率，因此测定血浆蛋白结合率对于理解化合物的活性以及组织分布有很重要的参考意义。 1. 结合蛋白类型 血浆蛋白主要作为载体负责各类外源性和内源性分子在循环系统内的转运。其中参与小分子药物结合的主要有白蛋白、α-1-酸性糖蛋白（AAG）、球蛋白和脂蛋白，主要以白蛋白和α-1-酸性糖蛋白（AAG）为主。药物与蛋白的结合强弱主要与药物-蛋白亲和力、蛋白丰度相关。 2. 血浆蛋白结合率常用测定方法 目前常用于药物血浆蛋白结合率测定的常用方法包括平衡透析法（Equilibrium Dialysis），超滤法（Utrafiltration Method），超速离心法（Ultracentrifugation Method），凝胶过滤法（Gel filtration）等。 其中，平衡透析法是基于药物结合的平衡原理来测定药物游离浓度最常用的方法，也是研究药物血浆蛋白结合率的经典方法。超滤法使用滤膜分立自由的药物和结合蛋白的药物，时间短，但确定点是药物容易结合到超滤过程使用的器械上，从而影响检测结果。平衡透析法虽然比超滤法耗时多一些，但它使用teflon镀层的平衡装置，能大大减少药物的非特异性结合，得到更精确的结果。目前，平衡透析法已有96孔板的高通量测试形式，可以实现同时测试大量候选药物的蛋白结合率。 平衡透析法 常用种属血浆：大鼠血浆，小鼠血浆，比格犬血浆，猴血浆，人血浆 分析方法：HPLC，LC-MS/MS，GC-MS等 各种药物以一定的比率与血浆蛋白结合之后，在血浆中会同时存在结合型与游离型两种类型，游离性药物具有药物活性。药物与血浆蛋白结合会成为结合型药物，暂时失去药理活性，并且储存于血液中，起到药库的作用，对于药物作用及其维持时间长短具有重要的意义。一般蛋白结合率高的药物体内消除慢，作用维持时间长，药效平稳。结合率低的药物体内消除快，同时作用时间短，药效有很大的波动。 平衡透析法测定血浆蛋白结合率是用透析膜将蛋白质溶液与缓冲液分隔开，建立在两者之间的一种平衡状态，只有分子量小的药物小分子可以通过。透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。透析的速度与膜的厚度、透析的小分子溶质在膜两边的浓度梯度及透析温度等因素有关。平衡透析法能够直接测出为与蛋白结合的药物小分子的数量，这是分析蛋白与小分子物质结合的关键，从而能够求出结合位点数及结合常数。 图1：分隔示意图 如图所示，利用透析膜将左右两室进行分隔，膜左侧加入含药的待测药物，膜右侧加入空白缓冲液，未被结合的游离药物可以自由穿过透析膜，孵育一定时间后两侧达到平衡，游离药物浓度相等，通过HPLC、LC-MS/MS或者GC-MS等方法测定两侧药物浓度，利用公式即可计算得到血浆蛋白结合率。这种透析膜只允许特定分子量的小分子通过，而阻止蛋白大分子通过。 平衡透析法在测定药物血浆蛋白结合率具有操作简单、温度易于控制、PH值可调、设备成本低廉等优点。但是同时存在达成平衡时间较长、溶液体积会变化，且透析时间过长可能会造成由加热或代谢引起的被测物质的降解等缺点。因此在利用平衡透析法测定药物血浆蛋白结合率，或者药物与蛋白质相互作用时需要与其他的一些方法联用，才能获得更准确的作用信息。一般只有血浆蛋白结合率高，分布容积小，消除慢以及治疗指数低的药物在临床上的这种相互作用才有意义。 3.血浆蛋白结合试验检测试剂盒 汇智泰康针对血浆蛋白结合率测定试验研发针对性的平衡透析装置，平衡透析装置包括96个透析池和透析池之间的透析膜组成，可以同时对多个样品进行透析测定，确定游离化合物比例。透析膜（半透膜）选用高分子膜，孔径可根据客户需求定制。 产品： 血浆蛋白结合平衡透析装置 血浆蛋白结合试剂盒 血浆蛋白结合试剂盒-猴血浆 血浆蛋白结合试剂盒-比格犬血浆 血浆蛋白结合试剂盒-大鼠血浆 血浆蛋白结合试剂盒-小鼠血浆 试剂盒组分： ①透析膜 ②不同种属血浆 ③PBS缓冲液 注意事项： ①影响血浆蛋白结合率测定的因素很多，如溶解度、温度、非特异性结合、酯酶代谢等，需要根据化合物特征，结合研究目的选择合适的测定方法进行实验。 ②如果有的药物具有很高的蛋白结合能力，试验条件的微小偏差可能会使试验结果出现较大偏差，从而大大提高血液中药物的浓度而引起毒性。 4.ADME服务项目 血浆蛋白结合率测定 代谢稳定性研究 肝微粒体代谢实验 肝细胞代谢稳定性试验 代谢表型研究 代谢产物鉴定 代谢途径鉴定 种属比较研究 细胞色素P450抑制实验（CYP450抑制试验，常用CYP450酶包括CYP1A2，CYP2A6，CYP2B6，CYP2C8，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6，CYP2E1，CYP3A4等） 细胞色素P450诱导实验（CYP450诱导试验） 血浆稳定性试验 跨膜转运试验 药物-药物相互作用 毒理学研究 购买方式： 电话：400-127-6686 微信：直接扫描右侧微信二维码添加购买